（微生物学专业论文）鸡艾美耳球虫核糖体小亚基序列分析.pdf

土鎏垃疆古堂亟堂僮迨窑 氇墓苤里韭垒丝趋生! 堡基庄型佥扭 摘要 鸡球虫病是一种由艾美耳球虫引起的危害极为严重的全球性寄生虫病，造成 严重的经济损失，在中国更为严重。本实验对实验室保存的4 种1 8 株艾美耳球虫 孢子化卵囊的1 8 sr d n a 序列进行克隆测序，其中1 5 株进行系统发育研究，另外3 株柔嫩艾美耳球虫地克珠利、马杜拉霉素和敏感株进行抗药性差异分析。 1 系统发育关系研究 为了确定来自不同地区鸡球虫种株的亲缘关系，研究其分类学地位，本项 研究对实验室收藏的堆型艾美耳球虫上海株( e a c e r v u l i n as h a n g h a is t r a i n ， e a s h ) 、堆型艾美耳球虫扬大株( e a c e r v u l i n ay a n g d as t r a i n ，e a y d ) 、巨型 艾美耳球虫上海株( e m a x i m as h a n g h a is t r a i n ，e m s h ) 、巨型艾美耳球虫 b a n k s a d d e 株( e m 础i m ab a n k s a d d es t r a i n ，e m b a ) 、巨型艾美耳球虫t y s o n s 株 ( e m a x i m at y s o n ss t r a i n ，e m t y ) 、巨型艾美耳球虫t o w n s e n d 株( e m a x i m a t o w n s e n ds t r a i n ，e m t o ) 、巨型艾美耳球虫连云港株( e m a x i m al i a n y a n g a n g s t r a i n ，e m l y ) 、毒害艾美耳球虫上海株( e n e c a t r i xs h a n g h a is t r a i n ，e n s h ) 、 柔嫩艾美耳球虫1 a 1 2 1 株( e t e n e l l a1 a 1 2 1s t r a i n ，e t a s ) 、柔嫩艾美耳球虫2 k f 株( e t e n e l l a 2 k fs t r a i n ，e t k f ) 、柔嫩艾美耳球虫2 y m 6 株( e t e n e l l a2 y m 6s t r a i n ， e t y m ) 、柔嫩艾美耳球虫吴株( e t e n e l l aw us t r a i n ，e t w u ) 、柔嫩艾美耳球 虫北京株( e t e n e l l ab e i j i n gs t r a i n ，e t b j ) 、柔嫩艾美耳球虫启东株( e t e n e l l a q i n d o n gs t r a i n ，e t q d ) 和柔嫩艾美耳球虫w l r l 株( e t e n e l l aw l r ls t r a i n ， e t w l ) 孢子化卵囊的18 sr d n a 基因进行克隆、测序，并与从g e n b a n k 下载的鸡 球虫18 sr d n a 序列，使用软件d n a s t a r5 0m e g a l i g n 进行系统发育分析：4 种艾 美耳球虫同源性在9 4 6 9 9 4 之间；7 株e 把，z 8 z 肠的同源性在9 9 0 9 9 9 之 间，5 f f k e m a x i m a 的同源性在9 6 9 9 9 8 之问。测序所得的4 种球虫f f u g e n b a n k 下载的4 种球虫1 8 sr d n a 序列构建的系统发育树显示，这8 种鸡艾美耳球虫( 另 外4 种球虫1 8 sr d n a 序列下载自g e n b a n k ) 形成2 个分支：i ，e a s h 、e m s h 、 e m i v d t i 、e m i t i s 、e b r u n e t t i 并d e p r a e c o x ；i i ，e n s h 和e t a s 。e m a x i m a 和e , t e n e l l a 各株的系统发育树均根据地域关系产生2 个分支。通过本实验进一步证明我国和 美国鸡球虫各种，株艾美耳球虫的分类地位；同时也为艾美耳球虫分子遗传学鉴 皇整凝熬塞皇壅圭堂黧豫塞婆薹羡鬟臻壅堑蕉整垒鬟蓬瑾塞登篓 定提供理论基础。 2 拣嚣整差舅分掇 为了研究抗球虫药地克珠利和马杜拉霉索对柔嫩艾美耳球虫1 8 sr d n a 的影 响，分别对本实验室人工诱鼯的柔嫩艾荧耳球虫地兜珠剩抗药珠( e , t e n e l l a a n t i ，d i c l a z u f i ls t r a i n ，e t a d ) 、柔嫩艾美耳球鱼马柱拉霉豢抗药珠( 菇t e n e l t aa n t i m a d u r a m y c i ns t r a i n ，e t a m ) 和柔嫩艾美耳球虫药物敏感株( e t e n e l l a d r u g s e n s i t i v es t r a i n ，e t d s ) 孢予化羚囊的1 8 sr d n a 基溅进雩亍竟隆、溺8 序，并通 过生物信息软件避行对比差异分析。通过软件d n a s t a r5 0m e g a l i g n 多序列眈对 发现：e t a m 株3 个碱基发生突变，t 1 7 0 突燮为c ，t 6 4 6 突变为c ，g 6 9 4 突变为c ； e t a d 攘1 个碱基发生突变，t 6 4 6 突变力c 。遴过软俘r n a d r a w1 ，1b + 分辑毙较发 现；e t a m 的二级结构与e t d s 的比较差异很大，而e t a d 的二级结构剡与e t d s 的完全相同。这些碱基的突变w 能是导致e t e n e l l a 产生抗药性原因之。本实验 磊马援控霉素撬芬拣帮逮壳拣稠靛药拣懿麓定，毪为挠瑟链产生豹壤疆提供了薪 的研究方向。 关键澜：艾美耳球虫；系统发脊挝：马杜拉霉素；她克珠利；抗药性；1 8 sr d n a 塑! 匝堇盔堂亟望僮迨塞 鸡篁羞基蔓虫垫擅笠! 堑基度到筮蚯 a b s t r a c t c o c c i d i o s i sc a u s e db y p r o t o z o a np a r a s i t e so f t h eg e n u se m e r i ai sa ne n t e r i cd i s e a s e o fm a j o re c o n o m i cw o r l d w i d ei m p o r t a n c e ，e s p e c i a l l yi nc h i n a 1 8 sr d n ao f1 8 s t r a i n so f4e i m e r i as p e c i e sw e r ep c ra m p l i f i e d ，c l o n e da n d s e q u e n c e df o r p h y l o g e n e t i er e l a t i o n s h i p sa m o n g15e i m e r i as p e c i e s s l r a i n sa n dd i f f e r e n c eb e t w e e n t h ea n t i d r u gs t r a i n sa n dd r u g s e n s i t i v es t r a i n 1 p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gt h ee m e r i as p e c i e s f o rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so ft h ee m e r i as p e c i e sf r o mc h i c k e n si ns o m ea r e a so f c h i n a ，18 sr d n ao ft h es p o m l a t e do o c y s t so f1s t r a i no fe n e c a t r i x 5s t r a i n so fe m a x i m a ，2s t r a i n so fe a c e r v u l i n a ，a n d7s t r a i n so fe t e n e l l aw e r ea m p l i f i e db yp c r t h ep r o d u c t so fp c rw e r ec l o n e di n t op g e m - te a s yv e c t o ra n ds e q u e n c e d b l a s t p r o g r a me x a m i n a t i o ns h o w e dt h a tt h ec l o n e dd n af r a g m e n t sw h i c hw e r ea b o u t18 0 0 b pi nl e n g t hw e r et h e 18 sr d n a so fa b o v em e n t i o n e de m e r i as p e c i e s s t r a i n s d n a s t a r5 0m e g a l i g ns o f ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h eh o m o l o g i e so ft h e18 sr d n a s o ft h e4e m e r i as p a c e sw a s9 4 6 9 9 4 t h eh o m o l o g i e so ft h e18 sr d n a so ft h e7 s t r a i n so f e t e n e l l aw a s9 9 0 - 9 9 9 a n dt h eh o m o l o g i e so f t h e1 8 sr d n a so f t h e5 s t r a i n so fe m a x i m aw a s9 6 9 - 9 9 8 t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew i t ht h e8e m e r i a s p a c e s ( 4s p e c e sd o w n l o a d e df r o mg e n b a n k ) f o r m e dt w oc l a d e s ，o n ew a sc o m p o s e d o fe a s h 、e m s h 、e m i v a t i 、e m i t i s 、e b r u n e t t ia n de p r a e c o x ，t h eo t h e rw a s c o m p o s e de n s ha n de t a s t h ep h y l o g e n e t i cw a sd i f f e r e n tf r o mt h a tr e p o r t e d p r e v i o u s e a c ho f t h et h ep h y l o g e n e t i ct r e ew i t ht h e7s t r a i n so f e t e n e l l aa n dw i t ht h e 5s t r a i n so fe m a x i m ah a st w oe l a d e sw h i c hb a s e do nt h ed i f f e r e n ta r e a t h i sr e s e a r c h s h o u l db eb a s i so nw h i c ht h eu l t i m a t ea n dd e f i n i t i v em e a n si se s t a b l i s h e df o ro r i g i n i d e n t i f i c a t i o no f t h ee i m e r i as p e c i e sf r o mc h i c k e n si nc h i n a 2 d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ee t e n e l l ad r u g - r e s i s t a n c es t r a i n sa n st h ed r u g s e n s i t i v es t r a i n t oa n a l y z et h ee f f e c to f t h ed r u gd i c l a z u r i la n dm a d u r a m y c i no nt h e1 8 sr d n ao f e t e n e a t h e1 8 sr d n ao fs p o r u t a t e do o c y s t so f t h ee t e n e l l aa n t i d i c l a z u r is t r a i n 3 土鲞删菹态堂瓒土堂焦逾塞 鹧墓差蔓然皇接趋然尘垩基鹰到蹬堑 ( e t a d ) e t e n e l i aa n t i - m a d u z a m i n c i ns t r a i n ( e t a m ) a n dt h ee t e n e l l a d r u g 一s e n s i t i v e s t r a i n ( e t d s )w e r ec o t o n e d ，s e q u e n c e da n dc o m p a r e db y d n a s t a r 5 0a n dr n ad r a w1 1b 。t i h ed n a s t a r 5 0s h o w e dt h a tt h r , e et y p e so f m u t a t i o n sw e r ef o u n di ne t a m ( c 1 7 0 ，c 6 4 6 ，c 6 9 4 ) a n do i l et y p eo f m u t a t i o nw a s f o u n di ne t a d ( c 6 4 6 ) 。t h er n ad r a wl ，ls h o w e dt h a th o m o l o g yb e t w e e nt h e e t a da n de t d s a n ds o m ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ee t a ma n de t d s t h em u t a t i o n o ft h e s eb a s e sm a yb er e l a t e dw i t ht h ed r u gr e s i s t a n c ei n 置t e n e l l a 飘l i sd i s c o v e r yi s t h ep o t e n t i a l l yb a s i cw o r kf o rf i n d i n gm o l e c u l a rm e c h a n i s ma b o u td r u g - r e s i s t a n c eo f e i m e r i at e n e l l aa n dn e wm a r k e ri nt h ed e t e c t i o no f r e s i s t a n c eo f e i m e r i at e n e l l a k e y w o r d s ：e i m e r i a ；p h y l o g e n e t i ct r e e ；d i c l a z u r i l ；m a d u r a m y c i n ；d r u g - r e s i s t a n c e ；1 8 s r d n a 4 圭查耍鎏煮黧堑坌茔壁盗塞整墓羞蔓蕊纛焦箍篷尘堑蕉壅捌壁堑 第一部分文献综述 鸡球虫病是一种内艾美耳球嗽引起的危害极为严重的全球性寄生虫病，严重 危害家禽的生长发育。几乎可以说，凡是养鸡的地方就有鹏球虫。集约化莽鸡场 噩| j 是球爨病爆发的鼗遁宣场所，英发病率为5 0 7 0 ，死亡率为2 0 3 0 ， 严重时离达8 0 【1 1 。在备种鸡病中，球虫病的发嫩率最高， 1 6 1 5 t z 3 】。据b h o g a l 等h 】估计，全世界每颦因球虫病撩成戆经济损失必2 0 亿美元。我国葬禽渡豹管理 水平参麓不齐，除了几个超大型鸿场外，其管联和防疫水平皆不及发这国家，所 以球虫瘸的损失也是相当可观的。 1 9 3 9 年l e v i n e l 5 t 罄次霰遵了磺黢类药耱美蠢控裁帮杀炎溶虫戆律鬻舜整了 使用化学药物治疗球嫩病的先河。后来，人们又陆续发现了多种治疗球融病的化 学药物，从而使用化攀药物预防和控制球虫病得到了推广，并沿用至今。然而， 麓着撬球斑药物静广泛使用，鸡球垂麴蠢| 药毪逐渐表臻爨寒。在畜狡篮生产中， 由于无法知道球虫何时对何种药物产生抗药性，结果造成普遍的盲目用药，导致 临床或受临床球虫病驰发生。其结果不但造成势物的巨大浪费，还经零鼯致药物 中毒，药物大量残瞽、环境污染。秘前条件下，由于球虫抗蓊性的杭理尚不清楚， 现有的抗药性检测技术由于所需时间长，费用高，不适应肉鸡快速生长的需要， 未能在生产实践中广泛应爱。 综述了真核生物核糖的的结构、功能、应用和鸡球虫核糖体的研究进展，以 及鸡球虫抗药性机理和检测方法灼研究进展。 圭壹艘瓢态堂壅堂建造塞婆童装照建皇蕉蕉韭尘黧基庄型坌堑 第一章真核生物核糖体r n a 研究进展 核糖体是由鬣白质和r n a 组成的一种溅细胞颗粒。它是翻译避行的场所， 提供骚白质合成过程中所需的各种生物活性物质。生长旺盛的高等真核生物每个 绥瑰畿健要合成约10 0 0 万仑孩糠体赋a ( r r n a ) 分子，形戏缝10 0 0 万个援糖葵。 核糖体的数目与细胞蛋白质合成的活性密切相关。当r n a 和蛋白质相互作用， 有的形成活性部位，有的提供构像形成一个复杂而有序的结合体【6 1 。 ir r n a 的结构 r r n a 是一秘蹇发重复序列，它具有爨下特点：嚣拨员之阕有褰凌豹序列 一致，甚至完全相同；拷贝数高，常有几十个，甚至几百个；非转录间隔区 ( n o n t r a n s c r i b e ds p a c e r ，n t s ) 短而一致。真核生物有5 8 s 、1 8 s 、2 8 s 和5 s4 种 r r n a ，蔫3 静r r n a f & 为主蕊r r n a 。主体r r n a 基因拷癸鼗隧生耱瑟黪，主谑r r n a 基因组成重复单位，转录出一个4 5 sr r n a ，然后通过转录后处理，切除转录的 间隔隧，成为1 8 sr r n a 、5 ，8 sr 鼢媳和2 8 sr r n a 。在所裔的真核生物中，5 sr r n a 基蠢舔楚多拷贝鹃，拷贝数在物i 争之阉差异经大。真挟生物静5 s 、2 8 s 萃嚣5 。8 sr r n a 虽以相等的比率彳挈在于核糖体的大亚基中但5 s 基因并不与5 ，8 s 基因连锁，可是 在原始的真核生物中，5 s 基因则与2 8 s 、1 8 s 、5 。8 s 基因逑锁，5 s 基因受另外一个 启动子控制。在原棱生物中，2 3 s 、1 6 s 、5 sr r n a 基因不仅连锁，雨量共用一个 启动予。一个重簸单位相对分子质量大约为8 l o 。各煎复单位之间的n t s 在各 豹静之越差冥很大。一般来说，孛亚基r r n a ( s m a l ls u b u n i tr r n a ，s sr r n a ) 的编码基因保守悛强，一般适合于种以一h 分类水平的研究。大亚蒸r r n a ( 1 a r g e s u b u n i tr r n a ，l sr r n a ) 的编码基因含较多的可变区基因，全序列分析后能用 佟各分类承乎兹磺究。在赛攘生秘豹r r n a 墓嚣各耍基潮豹墓霾竭嚣( i n t r a g e n i c s p a c e r ) 为高度重复序列，包括1 8 sr r n a 撼因与5 8 sr r n a 基因间的内转录l 区 ( i n t e m a lt r a n s c r i b e ds p a c e r - 1 ，i t s 1 ) 、5 8 sr r n a 基因与2 8 sr r n a 基因间的内 转交2 蘧( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r - 2 ，i t s - 2 ) 、n t s - 享麓，萁亭甍熬_ 羹复次数鸯 显著的株间差异，可用适当引物或探针以p c r 或s o u t h e r n 杂交法显示株间多态性 6 圭篷壤蕊塞堂亟圭茎毽逡塞， 蕉堇羞黧建垒垄夔整垒嚣薤凌型筮堑 1 7 l 。 2r r n a 的功麓 上世纪8 0 年代初，c e e h 实验室发现四膜威核糖体2 6 sr r n a 前体猩m 9 2 + 和鸟 蕾存在兹条箨下，不需要饪鹰鬣鑫震豹参与鼯虿自我羹落涂去蠹含子，善次涯弱 7 r n a 的催化功能。随着对r n a 催化功能的揭示与深人研究，人们淀意到“斟a 可能在蛋白质合成中起着更重要的作用，并获褥了遗传、生化和系统发育方面的 广泛豹实验 正撂，诞孵删尼乎参与了掰有接糖俸鲍渤缝反应，如m r n a 静选 择、t r n a 的结构( a 、p 、e 彼点) 、核糖体大小亚基的结合、翻译因子的结合、 校正阏读框、抗生索静作用、花义和译码突变的校正及铸号终止等。 2 1r r n a 与m r n a 之间相互作用 在蛋自质合成的三个主蘩辩籁( 超始、延长和终止) 都有特定碱基对静糖互 作用出现在r r n a 与m r n a 之间，如果配对不适合，就农降低核糖体对m r n a 的 识别缝力，影响鬣是质合成豹水平陶。 2 2t r n a 与r r n a 之间的作用 r r n a 必须傻t r n a 与m r n a 的羡密强予一密码子碱基正确秃谖遗配对在译 码位鼹上，同时t r n a 的一端在肽基转移酶位点上催化肽键的形成。译码位点 ( d e c o d i n gs i t e ) 是由t r _ n a 的进入位点氨酰瑟位点( as i t e ) 、歇基位点( ps i t e ) $ 1 t 6 sr r n a 的几个保守区结合在一起构成个复合的离度有序的络梅。除线歉 体 r r n a p b ，所有的r r n a ，猩i4 0 0 附近( 13 9 2 - 14 0 7 ) 的顺序也是非常保守 兹，凌这个毫度保守区有些突变并不影嫡核糖体豹功能，嚣另外一熬突变则对生 物体有害，妻l l c l4 0 0 核苷酸被g 芹e i a 替代将会抑制核糖体活力的8 0 和5 0 ，而被 u 替代时则无作用，影响最大的是g 14 0 1 的缺失，将使核糖体的全部功能被阻止 巍。疆基谈谖蘩拣k a 本身是囊接霹决定魏遮参与了蛋巍爱台残豹念过程，这个 过程中心是t r n a 结合到m i 斟a 以后的反应。当t r n a 结台至0 核糖体上，能防护在 1 6 sr r n a 上一高度保守的序列被结构特异的化学试剂的攻击，几乎所有的这些 7 圭鲞烂照本堂堑圭堂熊造塞 蕉垫美强戆蜜楚蕉垡尘骢蕊痉到筮堑 被保护的核苷酸，在1 6 s 或1 8 sr r n a q b ，都是非常保守的f l o 】。这些功能位点的组 分都鼹直接承担耱蛋白质合成过程中某些方面的任务洲。因此，它们的保守性 对蛋鑫蒺合戒翡正鬻进行，其鸯十分重要麓爨义。 2 3 r r n a 在核糖体亚单位联合中的作用 位于3 0 s 亚单位平台上的7 9 0 - - 7 9 2 区成环状的几个碱基恰好是和5 0 s 亚单位 接触的部位，这必碱基是非常保守的。# j 虫l l t a p p r i c h 1 糊将g 7 9 1 突变为a 7 9 l 后， 3 0 s 与5 0 s 之阉蕊联合、i f 3 怒始因子翡绩台鞫蛋鑫凌懿合藏羁显洚 氐了。 2 4 抗菌素与r r n a 之间的相互作用 许多抗菌素能干扰细胞蛋白质的合成，它是直接作用于核糖体的。现已发现 许多抗菌素的抗憾突变体都是幽r r n a 的结构改变所致，这是因许多抗菌素都能 壹接与r n a 缝褥怒裙互痒震羧于魏幸筝矮。m o a z c d 等吲磺究发魂大躲释蓥1 6 s r r n a 中一个高度保守的核苷酸c 9 1 2 突变为u 9 1 2 后便对链霉素( s t r e p t o m y c i n ) 产生抗性。h e i n o n e n 等【1 4 1 研究发现四膜虫对巴龙霉素( p a r o m o m y c i n ) 抗性则起 毽予1 8 sr r n a 中o t4 9 1 突变凳a 。m a n k i n 1 发现挠密旋霉素( p a c t a m y c i n ) 戆极 端嗜盐菌在1 6 sr r n a 的功能位点上存在突变点：a 6 9 4 ，c 7 9 5 ，c 7 9 6 ，且证明倾 囱予楚p a c t a m y c i n 巍接与3 个突变位点楣互俘用的结果。o c o n n o r 等【1 6 1 刘发现在 1 6 sr r n a14 0 9 i4 9 1 之间的区域对p a r o m o m y c i n 幂t l s t r e p t o m y c i n 敏躲，能产生抗 性和依赖。r e c h t 簿( 1 7 = i e n l 6 sr r n a 位点14 0 8 、14 0 7 14 9 4 或者14 9 5 的突变能 降低该送域与a m i n o g l y c o s i d ep a r o m o m y c i n 缭台戆亲和力。p f i s t e r 等l 埔l 通过研究证 明1 6 sr r n a 中位点g 14 9 1 与p a r o m o m y c i n 和g 4 1 8 硫酸盐( g e n e t i c i n ) 的抗药性高 度相关，而与新霉素( n e o m y c i n ) 、托普霉素( t o b r a m y c i n ) 和庆大霉索 ( g e n t a m i c i n ) 没蠢关系。e g e b j e r g 等l 拇泼瑗p 3 e 瓣珏y c 遮撵潮子大扬耪蘩菝糖落1 6 s r r n a 位点g 6 9 3 、g 7 9 5 ；天青帮素( c e l e s t i c e t i n ) 则对其2 3 sr r n a 饿点a 20 5 8 、 a 20 5 9 、a 20 6 2 、a 24 5 1 和g 25 0 5 有影响。朱昌亮等【2 0 】在抗溴氰菊酯淡色库蚊 r n a 惫泳蚕谱分橱中发魂，浚佼蓐蚊静l sr r n a 菇2 5 s 。 上盟垭煎左堂亟堂焦鎏塞 婆堇羞里韭皇擅揸佳! 垩基庄到登垄丘 2 5 r r n a 的催化功能 1 9 8 1 年c e c h 等【2 1 j 发现四膜虫r r n a 前体能通过自我剪接( s e l f - s p l i c i n g ) ，表 明r n a 也具有催化功能，称为核酶( r i b o z y m e ) ，这对“酶一定是蛋白质”的传统 观点是一次大的冲击，核酶可以催化许多反应，包括r n a 中磷酸二酯键的水解， 转移和连接，d n a 的水解，多糖苷键的水解和转移，氨酰酯的水解，转肽反应 等，与蛋白质的酶相比，核酶的k m 值较小，即与底物特异性结合的亲合力高； 由于锤头结构和发夹结构等核酶作用模型的成功建立已能人工合成设计各种核 酶，用以降解有害基因的r n a 产物，在临床医学和农业上具有广阔的应用前景， 核酶的应用已日趋成熟【2 2 1 。 3r r n a 的应用 3 i 进化分析 s sr i a 一级结构种系的保守性表现在所有种系中，有几段1 0 - 2 0 个核苷酸 顺序保持不变，代代相传，保守序列分布在核糖体的表面与核糖体的功能密切相 关，一旦这顺序中有一个碱基发生突变或缺失，就会影响其功能。但在其非保守 区域，随着时间的推移会不同程度地发生突变( 如碱基的插入、缺失、交换与颠 换等) 。v a w t e r 等 2 3 1 认为在不同结构和种类的碱基组成中碱基变化是一种相对速 率而不是一种固定的假想速率，并建立了一种计算相对速率的方法，该方法适用 于测定s sr r n a 的不同区域的相关进化速率和不同的相对交换与颠换速率。研究 发现长的单链r n a 区域变化最慢；碱基的偏好性组成与结构及系统发育地位有 关。正是由于s sr r n a 普遍存在于真核生物和原核生物的核糖体中，并具有一定 的进化速率，因而广泛应用于生物的进化分析上。s e h l e g e 等【2 4 j 通过对s sr r n a 序列的比较揭示了单细胞真核生物进化的多样性远远超过多细胞生物或原核生 物界。p e e r 等 2 5 1 由s sr r n a 建立的进化树促成了一个真核生物进化新观点的形 成。经典的进化观点认为动物、绿色植物和真菌几乎同时形成，这些进化的生物 体发生在较短的时间内并形成了大量的生活类型。此外，在真核生物的进化中， 原始的分支很快发生，随后有更多的分支发生。根据s sr r n a 数据，分支点被认 望垤整左堂亟堂焦鲨塞堕堇苤曼建虫蕉蕉生d ! 垩蕉鏖到佥盘 为是一个独立的进化种群，因为它是代表不同种群间的进化距离。 3 2 系统发育研究 由于s sr r n a 序列具有一级结构的相对保守性和二级结构螺旋的差异性，它 己被广泛应用于系统发育研究中。l e i p 等口6 】对月i 矾埘妇i n f l a t a 的s sr r n a 的系统 发育分析表明单独的寄生现象不能解释真核生物的分支体系，如营寄生生活的毛 滴虫( t r i c h o m o n a d s ) 、微孢子虫( m i c r o s p o r i d i a ) 及营独立生活的双滴虫 ( d i p l o m o n a d s ) 都处于真核生物分支的底部。d i p l o m o n a d s 、t r i c h o m o n a d s 和 m i c r o s p o r i d i a 之间的相对分支等级受外群原核生物的s sr r n a 中的g + c 含量的影 响，如果用高g + c 含量的原核生物做外群，则三者同处于真核生物的第一个分 支，如果用一定g + c 含量的原核生物做外群，贝l j d i p l o m o n a d s 不是从同一个分支 分离出来，而位于m i c r o s p o r i d i a 和l t r i c h o m o n a d s 之后分化的。 3 3 分类研究 通过对s sr r n a 的一级结构的相似性和二级结构差异的比较，可在分子水平 上进行系统分类。上世纪6 0 年代末，w o e s e 开始采用寡核苷酸编目法对生物进行 分类，通过比较各类生物细胞的r r n a 特征序列，认为1 6 sr r n a 及其类似的r r n a 基因序列作为生物系统发育指标最为合适：因为它们为细胞所共有，其功能同源 最为古老，既含有保守序列又含可变序列，其分子大小适合操作( 2 ”。i t s - 1 核苷 酸序列分析有其独特的优点：分子稳定( d n a ，非r n a ) 、精确( 双股链序列 被确定) 、简洁( 碱基长度2 0 0 b p ) 和具有菌株分型能力，因此作为一种精确、 省时的分类系统适用于密切相关菌株发生关系的研究7 1 。s t e v e n s 等2 8 1 通过s s r r n a 序列分析了锥虫属( t r y p a n o s o m a ) 的分类地位和进化关系。 3 4 疾病诊断 利用s sr r n a i 筝j 特异序列做探针进行p c r 特异性扩增已应用于疾病的诊断 上。e y s 等贮卿对利什曼原虫( l e i s h m a n i a ) 和研伊伽舳m 口的s s 斟a 序列中变化 最大的部分( 约8 0 0b p ) 进彳t t 比较分析，发现它们之间的序列存在很大的差异。 圭显凝熬左堂受童差焦造塞灏墓差堡鼗囊蕉蕉莲奎堡羞壅到垃薤 在l e i s h m a n i a 孛只发琥一个突交位点，良该痔翻设诗翡雩l 物律燕铮，可毫发将吴 地检出l 孵中以上的三8 渤州d 胛f “及其它寄生虫。此外，g u a y 等 3 0 1 利用s sr r n a 的i p c r 扩增采检测瘸原性弓形虫( t o x o p h a s m a ) ；万磊等孤1 和巢荚松等t 3 2 p c r 扩增特 定豹s sr r n a , 垮段检测疟原焱( p l a s m o d i u m ) 。 4 球虫r r n a 研究进展 缡珠虫缨戆中食有大量豹r r n a ，占总r n a 懿8 0 8 5 ，凌2 8 s 、1 8 s 、5 s 和4 s 组成。e l l i s 等【3 3 】用鸡球虫的p o l y ( a 一) r n a ( 主要为r r n a ) 探针和异源r r n a 探针( p r i bl ，为恶性疟舔盎的重维f r n a 基霞) 与鸡球淼基因缀d n a 的簿切片 段杂交，证盟r r n a 搽针和p r i bi 掇铮可用于检测鸡艾美霹球虫。从柔嫩艾美耳 球虫、堆型艾美耳球虫和毒害芟美耳球虫基因组d n ae c o ri 酶切片段的 s o u t h e r n 帮渎杂交强度分辑，涯鹗三者豹r r n a 基圜霉意度嚣源缝，基嚣掰磐基嚣 组结构中有较多的r r n a 基因存在，同时证明r r n a 基因探针可鉴别这些不问的球 虫。以p o l y ( a 一) r n a 探针从露柔嫩艾黄耳球虫翁基霞缀d n ab a m hi 酶切片 段构建的基因组文摩中筛选柔嫩艾燕耳球虫的r r n a 基因，这一党隆片段大小约 1 7 5k b ，但这一片段并不代表柔嫩艾美耳球虫r r n a 基因的完整簸合体，因为用 萁基瓣组d n a 送行s o u t h e m 杂交穗霹捡溺鬟嚣个b a m hi 激铡缝嚣段。璩盎与大 多数舆核生物一样，r r n a 基因由大量串选重复序列排列而成。根据本研究获得 晦克隆频率捺算，黎嫩艾美辉球虫约有1 3 0 拷爱静r r n a 基滋，两雏鳌艾美耳球虫 的r r n a 基因捌# 列更为复杂，在r r n a 基因间可能存在变异频率很离的间隔序列和 转座子样( t r a n s p o s o n 1 i k e ) 插入序列，因此堆型艾美耳球虫的r r n a 基因可能是 基毽缝豹突变热点帮整( h o t - s p o t ) 。 b a r t a 等【3 4 1 利用1 8 sr r n a 全序列分析了8 种鹏球虫的系统发育关系，认为 e n e c a t r i x 和e t a n e i l a 是姊妹种：e 坍打缸和e m i v a t i 是另一个姊妹种；e p r a e c o x 、 e m a x i m a 秘e ，b r u m e t t i 是亲缘关系较近熬另一个类群，恧这凡个姊捧摹孛又与 e a c e r v u l i n a 组成另支序，作者间时将8 种鸡球威的1 8 sr r n a 序列同e b o v i s 、 2 + s a r c o c y s t i ss p p ，t o x o p l a s m a g o n d i i 帮n e o s p o r ac a n i n u m 豹序歹l 避行琵较，发现 鸡球虫与e 。b o v i s 的亲缘关系较近。z h o u + t 3 5 1 用1 8 sr d n a 序列对啮齿类动物的 1 6 种艾美耳球虫进行系统分析，显示这1 6 种球虫可以明显的分为两个群辫，群落 上粪匝垂盔芏亟芏焦丝塞 婆堇差里蔓虫焦趋签d ! 堡基庄到垃圭丘 a 包括：e a l b i g u l a e ( f r o mn e o t o m a ) 、e a r i z o n e n s i s ( p e r o m y s c u s ， r e i t h r o d o n t o m y s ) 、e c h a e t o d i p i ( c h a e t o d p u s ) 、e c h o b o t a r i ( d i p o d o m y s ) 、 e d i p o d o m l y s i s ( d i p o d o m y s ) 、e 、l e u c o p i ( p e r o m y s c u s ) 、e o n y c h o m y s 妇 ( o n y c h o m y s ) 、e p e r o m y s c i ( p e r o m y s c u s ) 、和e r e e d i ( p e r o g n a t h u s ) ；群 落b 包括：e f a l c i f o r m i s ( m u s ) 、e 1 a n g e b a r t e l i ( p e r o m y s e u s ，r e i t h r o d o n t o m y s ) 、 e n i e s c h u l z i ( r a t t u s ) 、e p a p i l l a t a ( m u s ) 、e s c h o l t y s e e k i ( d i p o d o m y s ) 、 e s e p a r a t a ( r a t t u s ) 和e s e v i l l e t n s i s ( o n y c h o m y s ) 。这种特性与它们的卵囊 残体的形态结构类型相吻合。 5 sr r n a 基因相当保守，在基因组中以串连重复序列排列，但两侧的侧翼序 列( 基因间区，i n t e r g e n - r e g i o n ) 突变频率却甚高，具有明显的种间差异。s t u b k i 等【3 6 1 用标记的柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫基因片段做探针，从柔嫩艾美 耳球虫的基因组文库中筛选出大小为3 4 0b p 含5 sr d n a 的基因片段，与g e n e m b l 基因数据库相比较，揭示其中含有1 2 0 个核苷酸组成的完整的5 sr r n a 结构基因， 还含有位于该基因两侧的部分侧翼序列，用反 向p c r 技术从基因组d n a 中扩增出 6 0 8b p 长的5 sd 斟a 侧翼序列。结果证明柔嫩艾美耳球虫的5 sr r n a 基因簇是由 这7 2 8b p 长的重复单位串连排列在同一条染色体上。目前，这一基因已得到完全 测序，其结构基因部分相当保守，与多种纤毛虫和低等植物有明显的同源性，小 亚基单位r r n a 基因的部分测序表明，艾美耳球虫与肉孢子虫属和弓形虫属的亲 缘性大于其与疟原虫属的亲缘性，且在同属内，不同的宿主的同一部位侵入的各 种球虫之间的联系较同一宿主内侵入不同部位者之间有更密切的联系，而其侧翼 序列部分具有高度的种特异性。根据间隔序列测序所合成的引物进行p c r 扩增， 能特异地检出少至1 0 个卵囊的柔嫩艾美耳球虫，但p c r 扩增不能检测出与其他种 艾美耳球虫。 s c h n i t z l e r 等3 8 1 发1 霞ts p e c i e s s p e c i f i cp c r 技术扩增i t s 一1 序列检测鸡艾美 耳球虫。b a r t a 等3 明克隆测序t i t s 1 、5 8 sr r n a 、i t s 2 ，发现北美的5 种e m a x i m a 的i t s i 并1 3 i t s 2 序列具有很高的可变性。l e w 等h 0 1 比较分析澳大利亚7 种艾美耳球 虫i t s 一1 序列并用系统发生关系评估它们的进化关系。s u a 等 4 q 利用i t s 1 的可变 区序列设计特异性引物鉴别诊断了台湾5 种艾美耳球虫种( e a c e r v u l i n a ， e b r u n 已t t i ，em a x i 搠口，e 门p c 口t r i x ，a n de t e n e l l a ) 。w o o d s 等f 4 2 】通过p c r - r f l p 尘攫燧蕊去堂亟圭掌燕缝塞叠堇蘸嚣整塞燕蕉壁垒瓤基壁型筮堑 技术分析了澳大利亚6 种艾奖耳球虫种( e a c e r v u l i n a ，e b r u n e t t i ，e m a x i m a ， e n e c a t r i x ，e a p r a e c o xa n de t e n e l l a ) i t s - 2 ，它们的长度大约在7 0 6 2 0b p 2 _ l 日- ， 说鞠i t s - 2 是很磐浆基因标记。 上蓬娅堇盍堂亟点警熊逢塞强冀燕盟瑾查捷擅笠d ! 理瑟鹱劁盐堑 第二章鸡球虫抗药性研究进展 直到目前为止，控制鸡球虫瘸的主要手段还是依赖于抗球虫药。但怒由于抗 辣虫药豹广泛饺嬲，冤其是抗球擞药豹经料绘药，镬褥摭球虫药长期、漕遍地使 用，鸡球虫獍蓊幢的产生也就不霹避免了。1 9 4 5 年，在美雪首次分离滋辩磺胺类 药物具有抗药性的抗药虫株【