（动物营养与饲料科学专业论文）谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究.pdf

摘要本试验的目的是以谷朊粉为原料，研究筛选出获得含谷氨酰胺生物活性肽的最佳酶解工艺条件。主要研究了：( 1 ) 胰蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶单酶水解优化工艺条件；( 2 ) 双酶组合水解的优化工艺条件，包括胰蛋白酶和复合蛋白酶组合酶解和胰蛋白酶和风味蛋白酶组合水解；( 3 ) 水解产物的分子量分布，并测定了水解产物中谷氨酰胺的含量；( 4 ) 对水解产物进行喷雾干燥试验，获得了干燥产品，并对产品的分子量、谷氨酰胺含量、粗蛋白、水分含量进行测定。试验结果表明：( 1 ) 单酶水解的最佳条件是：胰蛋白酶：【e 】8 ，【s 】为1 5 ，p n 值为8 5 ，温度4 0 c ，时间4 h ，水解度1 2 3 8 ；复合蛋白酶：i n l 5 ，【s 】为1 5 ，p h 值为6 3 ，温度为5 0 ，时间7 l l ，水解度为1 5 6 9 ；风味蛋白酶：【】巳】1 5 ，【s 】为1 5 ，p h 值为6 5 ，温度5 5 ，时间8 h ，水解度为1 9 4 1 ；双酶组合水解的最佳工艺条件是：胰蛋白酶和风味蛋白酶复合，其中胰蛋白酶匝】8 ，【s 】为1 5 ，p n 值为8 5 ，温度4 0 ，时间4 h ，风味蛋白酶圆1 5 ，【s 】为1 5 ，p h 值为6 5 ，温度5 5 ，时间8 h ，水解度为2 8 8 1 ；胰蛋白酶与风味酶复合酶解水解产物分子量大部分都在1 0 0 0 d a 以下，水解效果好于单酶水解和胰蛋白酶与复合酶复合水解效果；( 3 ) 胰蛋白酶和风味酶水解产物中谷氨酰胺的含量为2 5 1 9 6 p t m o l l ；( 4 ) 经高速离心喷雾干燥法干燥的产品的分子量大部分都小于1 0 0 0 d a ，谷氨酰胺的含量为2 1 4 5 1 p m o f l ，所得产物蛋白质含量为8 9 0 9 ，水分含量为6 3 7 。关键词：谷朊粉；酶解；谷氨酰胺；生物活性肽a b s t r a c tt h ea i mo ft h i st h e s i si st os c r e e no u tt h eo p t i m u mm a n u f a c t u r i n gt e c h n o l o g i e so fb i o a c t i v ep e p t i d e sw i t ha b u n d a n tg i nf r o mw h e a tg l u t e nm e a lb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s t h es t u d ym a i n l yi n c l u d e ：( 1 ) h y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fs i n g l ee n z y m a t i cr e a c t i o nw e r ed e t e r m i n e da n do p t i m i t 捌f o rt r y p s i n , p r o t a m e xa n df l a v o u r z y m e ( 2 ) t h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fc o m p o u n d 蜊a t j cr e a c t i o nw o r ed e t e r m i n e da n do p t i m i z e df o rt h ec o m b i n a t i o no ft r y p s i na n dp r o t a m e x ，t r y p s i na n df l a v o u r z y m er e s p e c t i v e l y ( 3 ) t h ed i s t r i b u t i o no f m o l e c u l a rw e i g h to f a b o v eh y d r o l y s i sp r o d u c t sa n dt h ec o n t e n to f g i n w e r et e s t e d ( 4 ) t h ee n l a r g e de x p e r i m e n tw a sd o n ea n dc e n t r i f u g a ls p r a yd r y i n gw a su s e d t h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t , t h ec o n t e n to f g i n , c pa n dw a t e rw o r em e a s u r e d t h er e s u l t ss h o w e da sf o u o w s ：( 1 ) t h eo p t i m u mh y d r o l y s i sc o n d i t i o n sf o rs i n g l ee n z y m ea r e ：f o rt r y p s i n ：e n z y m ec o n c e n t r a t i o n8 ，s o l i d l i q u i dr a t i o1 5 ，p h8 5 ，t e m p e r a t u r e4 0 c ，r e a c t i o nt i m e4 h , d h1 2 。3 8 ；f o rp r o t a m e x ，髓z y m ec o n c e n t r a t i o n1 5 ，s o l i d l i q u i dr a t i o1 5 ，p h6 3 ，t e m p e r a t u r e5 0 c ，r e a c t i o nt i m e7 9d h1 5 6 9 f o rf l a v o u r z y m e ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n1 5 ，s o l i d l i q u i dr a t i o1 5 ，p h6 5 ，t e m p e r a t u r e5 5 c ，r e a c t i o nt i m e6 h , d h1 9 4 1 t h eb e s td o u b l ec n z y m ec o m b i n a t i o nh y d r o l i s i s ：t r y p s i na n df l a v o a r z y m e ，f i r s ts t e p ,t r y p s i nh y d r o l y s i s ：e n z y m ec o n c e n 订a t i o n8 ，s o l i d l i q u i dr a t i o1 5 ，p h8 5 ，t e m p e r a t u r e4 0 c ，r e a c t i o nt i m e4 h ，a n dt h e nf l a v o u r z y m e ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n1 5 ，s o l i d l i q u i dr a t i o1 5 ，p h6 5 ，t e m p e r a t u r e5 5 c ，r e a c t i o nt i m e8 h , t h ed hi s2 8 8 1 ( 2 ) t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h em o s th y d r o l y s i sp r o d u c t si sl o w e rt h a n1 0 0 0 d ab yt h ec o m b i n e dh y d r o l y z a t i o no f t r y p s i na n df l a v o u r z y m e t h eh y d r o l y t i cc a p a b i l i t yo fc o m p o u n de n z y m ea r cb e t t e rt h a ns i n g l ee l l z y l h e 0 ) t h eg i nc o n t e n to fh y d r o l y s i sp r o d u c tb yc o m b i n a t i o no ft r y p s i na n df l a v o u r z y m eh y d r o l y s i sp r o d u c t2 5 1 9 6 p m o l l ( 4 ) t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h em o s th y d r o l y z e dw h e a tg l u t e np c p r i d e st h r o u g hc e n t r i f u g a ls p r a yd r y i n gi ne n l a r g e de x p e r i m e n ta r es m a l l e rt h a n1 0 0 0 d a ，a n dt h ee n l a r g e dp r o d u c tc o n t a i n s8 9 0 9 o fp r o t e i na n d6 3 7 o fw a t e ra n d2 1 4 5 1 m o l lo f g l mk e y w o r d s ：w h e a tg l u t e nf l o u r ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；g i u t a m i n e ；b i o a c t i v ep e t i d e s独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签名：毒盔鱼日期：2 蟹：上：墨2关于论文使用授权的说明本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：壅遣j 日期：趔：皇：!导师签名：圣盟日期：之亏p有关知识产权的保证本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。本人在校期间的研究成果及发表的论文，知识产权归河南工业大学所有。本人毕业后发表的、以本人在校期间研究成果为基础完成的论文、研究报告及其它科研成果，将署名河南工业大学为作者单位。论文作者签名：壅蕴商日期：砂7 上弓d导师签名：二塞丛虱一日期：兰世谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究1 1 本课题研究的意义第一章前言谷氨酰胺( o l u t a m i n e ，g i n ，q ) 为条件性必需氨基酸，其在生物体代谢过程中起重要作用，已经在医学临床、动物生产上有了一定应用并取得明显效果。但g l i l 的难溶性和不稳定性限制了它的推广和应用【5 9 】。为了克服g i n 的这些缺点，人们主要采用g i n 结合肽( g l n b o u n dp c p t i d e ) ，发现g i n 结合肽能克服游离g i n 的缺点。目前临床上使用的主要是人工合成的g l n 二肽( a 1 a - g h 和g l y o l n ) t a 。但是g i n 结合肽的合成量低，价格昂贵，其广泛应用仍然受到限制。研究从富含g i n 的蛋白质通过有限酶解制各谷氨酰胺结合肽( 酶解肽) ，应用于动物生产可能是一个经济有效的途径。面筋蛋白含有大量的谷氨酰胺。s u g i y a m a 的研究认为谷蛋白中丰富的g l x 主要是g i n ，其q b g l n ：o l u 为9 6 ：4 1 6 2 1 。c h l i c h t h e r l ec e m y 的研究发现谷蛋白水解后的溶液中游离的g i n 的浓度是g l u 的3 倍以上【6 l 】。因此要酶解获得富含gln 肽，谷蛋白是优先考虑材料。谷朊粉中含量最高的谷氨酰胺化学性质很不稳定，在强酸、强碱、高温下会分解，而且高温下产生有毒的焦谷氨酸【4 5 】。故与酸法和碱法相比较，酶法水解具有条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、水解程度容易控制，特别是在营养成分的保留上，具有不可比拟的优点。因此本课题选用酶法来水解谷朊粉生产富含g i n 的小肽液。我省是主要的小麦生产大省，小麦淀粉生产企业因谷朊粉没有好的销路而导致小麦淀粉企业生产成本增高，限制了企业的生产和经济效益，也直接导致小麦转化利用程度降低。生产谷朊粉水解蛋白饲料可提高小麦深加工的附加值，实现小麦粉的综合利用，为小麦加工企业提供谷朊粉利用的高新技术，开拓新的市场。1 2 谷朊粉的研究进展谷朊粉又称小麦面筋蛋白，又叫做活性面筋粉，其蛋白质含量在7 0 8 0 ，且氨基酸组成比较齐全，是营养丰富、物美价廉的植物性蛋白源。当谷朊粉吸水后形成具有网络结构的湿面筋，具有一定的粘弹性、延伸性、热凝固性、乳化性以及薄膜成型性等功能特性，而且含氨基酸种类较多，可作为一种天然的保健食品添加剂或配料，在食品安全方面具有极大的优势，因此它被广泛的应用于食品、各种专用面粉、营养保健食品等行业。河南工业大学硕士学位论文1 2 1 谷朊粉的理化特性与营养价值谷朊粉是小麦淀粉生产的副产物。谷朊粉蛋白质含量与小麦的品种、品质有关，差异很大，一般为9 7 1 7 7 ，直接影响小麦粉的品质。谷朊粉蛋白主要的蛋白成分包括：麦醇溶蛋白，约占4 9 ，麦谷蛋白，约占3 9 ，清蛋白，约占4 ，以及球蛋白，约占8 t 。谷朊粉中蛋白质含量丰富，含量在7 0 - - 8 0 ( 干基) 左右，此外还含有5 1 0的脂质，少量的碳水化和物和矿物质【2 。谷朊粉蛋白中麦醇溶蛋白呈球形，为单体蛋白，分子量较小( 2 5 k d 1 0 0 k d ) ；麦醇溶蛋白能溶于7 0 8 0 的乙醇水溶液，不溶于水、稀盐和无水乙醇溶液，组成上的特点是脯氨酸和酰胺含量较多，非极性侧链远远多于极性侧链，分子内既无亚基结构，又无肽链间二硫键，单肽链间依靠氢键、疏水键以及分子内二硫键连接，形成比较紧密的三维结构。麦醇溶蛋白多由非极性氨基酸组成，故富有粘性和膨胀性，其主要为面团提供延展性【3 】。麦谷蛋白是一种非均质的大分子聚合体，呈纤维状，分子量较大( 4 0 k d a 3 0 0 k d a ) ，其中某些聚合体分子量甚至高达百万k d a 。能溶于稀酸和稀碱溶液，不溶于水、醇和中性盐溶液。普通小麦粒中的麦谷蛋白一般是由1 7 2 0 种不同的多肽亚基组成的，靠分子内和分子间二硫键连接，其氨基酸组成多为极性氨基酸，容易发生聚集作用，肽链间的二硫键和极性氨基酸是决定面团强度的主要因素，它赋予了面团以弹性。麦醇溶蛋白和麦谷蛋白这两种独特的氨基酸组成赋予了谷朊粉蛋白能够形成具有粘弹性的网络结构的特性，使谷朊粉蛋白具有很好的延伸性、粘弹性、持水性、薄膜成型性和吸脂乳化性1 4 j 。谷朊粉、麦谷蛋白、麦醇溶蛋白的氨基酸及组成见表1 - - i t 5 j 。从表l 一1 可以看出，这三种蛋白质中都含有大量的谷氨酸( 多以酰胺形式存在，约占1 3 ) ，谷氨酸和天冬氨酸共同在蛋白质的侧链结构中参与氢键的形成，在稳定蛋白质的结构、提高麦谷蛋白和醇溶蛋白的交联作用方面发挥重要作用；谷朊粉蛋白中含有的碱性氨基酸( 如：精氨酸、组氨酸、赖氨酸) 较少；含有大量的非极性氨基酸残基，如亮氨酸、脯氨酸，它们以疏水键交互作用存在，进一步降低了其亲水性嘲；谷朊粉蛋白中脯氨酸的含量也比较高，由于脯氨酸的环状结构，肽链在此位点有一转折，使面筋蛋白无法形成a 一螺旋结构，从而形成大量的氢键。故谷朊粉水溶性较差，溶解度低。1 2 2 谷朊粉的生产与应用小麦面粉中加入适量的水再用手或机械揉和即得粘聚在一起并具有粘弹性的面块，这就是所谓的面团。静置之后，面团在水中搓洗，淀粉、麸皮渐渐离开面团而悬浮在水2谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究中，最后只剩下具有黏性、延伸性和橡胶似的物质，这就是所谓的面筋。这种面筋含水分6 5 7 0 ，称湿面筋，烘去部分水，称为干面筋，经粉碎后称谷朊粉。2 0 0 多年前意大利科学家比凯里就从小麦中分离出小麦蛋白即谷朊粉。随后，小麦蛋白的生产技术迅速发展，我国生产小麦谷朊粉也有着悠久的历史。谷朊粉的生产可以分为两大部分：先分离出湿面筋，再对湿面筋进行干燥。面筋的分离方法有湿法、干法、溶剂法等多种方法【刀。目前已经有的谷朊粉制取工艺包括：离心分离法、马丁法、漩流法、小麦全湿法、干法分离小麦蛋白等 8 1 。表1 - - 1 谷朊粉、麦谷蛋白及醇溶蛋白的氨基酸组成( )t a b 1 1a m i n o p h e n o lc o m p o n e m t o f v i t a l g l u t e n a n d g l i a d i n 一o河南工业大学硕士学位论文马丁法是一种较早的传统的谷朊粉生产工艺，其制作过程是：把面团置于喷成雾状的水里揉捏一段时间后，淀粉被洗出，面筋凝聚成团，再经烘干、分级和筛理得到谷朊粉；离心分离法，或者叫面浆法，它的基本原理是利用离心力将面粉中比重不同的成分淀粉与谷朊粉在悬浊液( 面浆) 中分离开来，然后利用环流气体干燥系统进行瞬时高温干燥从而获得高质量的淀粉与谷朊粉；湿法分离谷朊粉是将小麦先进行浸泡，然后进行捣碎磨浆，离心分离，最后烘干粉碎，得到谷朊粉；干法分离小麦蛋白粉，其工作原理是将原料导入高速旋转的粉碎机，经过打击碰撞后的面粉，胚乳蛋白质从淀粉颗粒上脱落，分裂成蛋白质颗粒与无数单体淀粉颗粒，混合粉粒进入分级机，根据其动力学特性，将它们分离开来，再经过袋式滤尘器过滤与气流分离，最后得到小麦蛋白粉；漩流法的生产工艺流程是将面粉与水混合，形成面团，在一定温度下熟化调浆，然后将悬浮液泵入漩流器组，再经过筛分、烘干得到小麦面筋蛋白粉唧。在现在食品中谷朊粉通常作为食品添加剂，品质改良剂。谷朊粉蛋白具有良好的延伸性、粘弹性和持水性。利用这一特性，谷朊粉在饲料工业中用于生产高档水产品如螃蟹、鳗、鳖、对虾等饲料的粘结剂和营养强化添加剂，这不仅提高了饲料的营养价值，在制作悬浮饲料时，其吸水后的悬浮性，自然粘弹性还提高了饲料在饲喂中的综合利用率。另外与动物蛋白相比，谷朊粉氨基酸丰富，但赖氨酸含量较低，在饲料工业中，可以将谷朊粉作为优良的植物蛋白源，与其它食物性蛋白按一定比例混合，作为高档动物及宠物的饲料。因此谷朊粉在保健食品、婴儿食品中得到了广泛应用【l o 】。1 3 生物活性肽的研究进展肽是由两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的有机化合物，肽链中含有的氨基酸数量小于1 0 的称为寡肽。如果这些寡肽具有生物一定的活性，具有特殊的营养作用和生理功能，他们被称为生物活性肽或功能肽【l ”。研究证明，以数个氨基酸结合生成的寡肽比氨基酸有更好的消化吸收性能，且营养和生理效果更为优越。不仅如此，其中许多种肽还具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能。这些生物活性肽都以非活性状态存在于蛋白质的结构之中，当用适当的蛋白酶水解时，它们的活性就可以被释放出来。1 3 1 生物活性肽的功能1 3 1 i 生物活性肽的营养价值4谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究动物摄入的蛋白质在肠道内消化后可释放出游离氨基酸和寡肽，与氨基酸相比，寡肽的营养作用主要体现在以下几方面【1 2 】：消除游离氨基酸的吸收竞争，加快蛋白质的合成。促进矿物元素的吸收作用。由于有些小肽具有与金属结合的特性。从而促进c a 2 + 、f e 2 + 、c u 2 + 和z n 2 + 的被转运过程及在体内的储存，在饲料中应用能极大减少骨骼畸形现象。改善机体的免疫调节，提高其免疫机能。早在1 9 8 2 年，j e l l e 就报道了b 酪蛋白水解产生的三肽和六肽可促进巨噬细胞的吞噬作用，提高动物免疫力。提高动物的生产性能。肽的吸收具有转运快、吸收效率高、耗能低、载体不易饱和等优点，同时作为中间产物，可直接被组织蛋白质合成利用，参与组织蛋白质的合成与调节，而游离氨基酸没有调节作用1 1 3 1 。另外，体内小肽还可以促进葡萄糖的转运，而且并不增加肠组织氧的消耗。1 3 1 2 生物活性肽的生理功能生物活性肽的主要功能表现在以下几个方面：抗菌、抗病毒，例如：抗菌肽、干扰素、内白介素及生物防御素等；降血压、降血脂，例如：降血压肽( a c e i ) ；消除疲劳；镇痛，例如：鸦片活性肽；延缓衰老；调节免疫、调节内分泌；抑制血小板聚集和血管收缩；防治糖尿病；抗氧化、抗风湿作用；促进钙、铁吸收；o d 调节食品风味、口味、硬度等【1 4 1 【1 5 11 3 2 生物活性肽的生产方法随着生物技术的发展，为人们从食品蛋白质中生产出特殊的活性肽提供了条件。人们获得活性肽的来源有：存在于生物体中的各类天然活性肽( 激素类、酶抑制剂等) ；消化过程中产生或体外水解蛋白质产生的活性肽；通过化学方法( 液相或固定相) 、酶法、重组d n a 技术合成。分述如下：1 )生物提取：提取存在于生物体中的各类天然活肽，如从细菌、真菌、动植物等生物体内提取激素、酶抑制剂等天然活性肽。2 )酸或碱水解：该法虽简单价廉，但酸水解会破坏l 一型氨基酸使其转变为d 一型氨基酸和有毒物质，而碱水解产物有异昧，水解条件难控制而应用较少。3 ) 化学合成：采用液相或固相化学合成法可制取任意需要的活性肽，但因成本高，副反应物及残留化合物多，目前此方法仅在实验规模中使用。4 ) 重组d n a 法：该法制取活性肽的试验研究尚在进行中。s ) 酶法生产：该法是目前生产生物活性肽的最主要的方法，其优点是产品安全性极高，生产条件温和、高效，对蛋白质营养价值破坏小，可定位生产特定的活性肽，成本低。河南工业大学硕士学位论文但同时也存在一些缺点，最主要的是副反应多，特别是对肽键的水解，导致在合成大分子寡肽时会产生大量副产物；另外一个问题就是许多氨基酸衍生物在水中的稳定性很差。虽然“非水相酶学”获得了长足的发展，但现仍局限在模型二、三肽的合成。此外，在蛋白质酶水解时会形成苦味肽，这严重限制了蛋白质水解物的利用。因此许多脱苦方法应运而生，包括选择性分离、掩蔽、酶处理等。1 3 3 生物活性肽在饲料行业的应用在饲料工业，生物活性肽饲料添加剂是一种绿色营养型饲料添加剂，具有生物活性并可促进动物生长和保健的有机物质。由于生物活性肽的应用对节约蛋白质饲料、提高动物生产性能具有重要意义，所以生物活性肽在饲料行业应用广泛，其中主要包括：替代部分抗生素：作为天然防腐剂；提高饲料品质；作为矿物元素载体，促进机体对矿物质的吸收；改善饲料风味，提高饲料适口性；满足畜禽的营养需要，促进机体生长等【1 6 1 。1 4 谷氨酰胺及其活性肽的研究进展动物在应激、感染、刨伤、烧伤、过度疲劳等情况下，机体处于高分解代谢状态，机体对谷氨酰胺的需求量大大超过了机体的合成能力，导致血浆和细胞中谷氨酰胺的浓度降低，蛋白质合成减少，影响机体正常的生命活动，此时必须从外界摄取才可防止机体代谢的失衡。如果补充谷氨酰胺则会减少肌肉的分解，缓解谷氨酰胺的快速耗竭。在这种情况下，谷氨酰胺被认为是必需的，因而被称之为条件性必需氨基酸( c o n d i t i o n a l l ye s s e n t i a l 触o a c i d ) ，即在正常情况下，动物机体能合成足量的谷氨酰胺满足自身正常生命活动的需要，而在创伤、烧伤、过度疲劳、断奶等应激状态下，机体合成不能满足机体需求，必须从外界摄取才可防止机体代谢的失衡【l - q 。黄耀凌等研究发现补充g l n 能极显著延长小鼠的游泳致死时间，提高小鼠的抗疲劳能力 1 明；实验还发现给仔猪补充g i n 能提高仔猪抗断奶应激能力【1 9 1 。谢新民等研究发现添喂g 1 n 对肉鸡短期内抗急性热应激具有良好的效果1 2 0 j 。1 4 1 谷氨酰胺的生化、生理学特性和营养价值g 1 n 是一种动物的非必需中性氨基酸，分子量为1 4 6 1 ，分子式为c 5 h 1 0 0 型n 2 ，有两个氨基，一个是a 一氨基和一个是易水解的末端氨基，几乎在机体所有组织中都能合成，在组织间氨的转运过程中起着重要的载体作用叫。6谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究谷氨酰胺( g l u t a m i n e ，g l n ，q ) 是动物和人机体中含量十分丰富的氨基酸，其血浆浓度为0 5 0 9 m m o l l ，除牛磺酸( t a u r i n e ) 外，谷氨酰胺是全血游离氨基酸池中含量最高的氨基酸( 约占5 0 以上) ；在骨骼肌细胞内游离氨基酸池中，含量也最为丰富( 约占6 0 以上) ，它对各器官和组织细胞具有重要而独特的生理功能【捌：谷氨酰胺水解脱酰氨基后生成谷氨酸，剩余的a 一氨基通过转氨基途径在其他各种小氨基酸的生成中起着重要的作用；谷氨酰胺为嘌呤、嘧啶、氨基酸、蛋白质、核酸等生物大分子合成提供重要碳、氮前体；谷氨酰胺是肾脏产氨的最重要底物，对酸碱平衡的调节起着十分重要的作用；谷氨酰胺为肝糖原异生提供重要底物；肝脏中的谷氨酰胺是捕捉氨的主要载体和终末产物，具有解毒的功能；谷氨酰胺为快速生长和分化细胞，如血管内皮细胞、淋巴细胞、肠粘膜上皮细胞、肿瘤细胞提供重要燃料；谷氨酰胺是某些谷氨酰胺依赖细胞，如肠粘膜上皮细胞的重要供能物质；谷氨酰胺是蛋白质代谢的重要调节因子，如促进细胞内蛋白质等生物大分子的合成，减轻骨骼肌中蛋白质的分解。谷氨酰胺的主要代谢去路和功能如图1 1 和图1 2 田】爨j 翥捉嘌呤嘧啶代谢燃料氨基酸池生物合成f f 葡萄糖+ 一l - 谷氨酰胺一磷酸葡萄耱j 氨气生成氨甲酰磷酸氨基酸图1 1 谷氨酰胺的主要代谢去路f i 9 1 - lt h em a i nm e t a b o l i s ma p p r o a c ho f g i n1 4 2 谷氨酰胺活性肽的生产方法糖原一l - 谷氨酰胺卜氨气i 蛋白质降解蛋白质合成碳，氮运动图1 2 谷氨酰胺的主要功能f i g l - 2t h em a i nm 鲍t b o l i s mf i n c d o no f g l n谷氨酰胺在临床营养方面的研究和应用，为g l n 在畜禽养殖的应用提供了借鉴。但g i n 的溶解度低，而且在溶液中不稳定，在加热灭菌的条件下容易生成有毒性的焦谷氨酸和氨，因而市场上的氨基酸制剂中都不含g l n 。目前g i n 的应用主要有几个方式：现配现用，把g i n 晶体加到氨基酸溶液中，然后过滤除菌，在八h 内输完。该过程必须严格无菌操作且工作繁琐、费时，使用范围受到限制。是合成g l i l 衍生物，如乙酰谷氨酰胺刚科- a c e t y l - g l u t a m i n e ) ，它合成容易，加热稳定，在体内可形成g l n ，但它的利用率较7河南工业大学硕士学位论文低，实际应用中损失太大。谷氨酰胺结合肽，目前常用的有g l y - o l n 和a l a - g i n 。在体内这两种二肽很快被分解为其组成的氨基酸。健康人体长期静脉注射谷氨酰胺二肽没有任何副作用及不良反应。谷氨酰胺二肽在人类临床上已经得到了广泛的应用，但由于二肽的成本高，限制了其在动物生产上的应用。而某些植物蛋白中含有丰富的g i n ，如小麦面筋蛋白和玉米醇溶蛋白，这逐渐受到了动物营养学家们的重视。黄熠凌等用谷蛋白酶解肽灌喂2 1 日龄断奶仔猪，发现正常断奶组仔猪体重增加与酶解肽组相比差异不显著，酶解肽组与早期断奶组体重增加差异显著，实验还发现补充酶解肽能维持早期断奶仔猪机体血浆的g i n 库，与游离g i n 的作用相近。杨小军等用自制面筋蛋白胃蛋白酶水解物灌喂s d 大鼠，发现酶解物可显著促进大鼠免疫脏器的生长、增进腹腔巨噬细胞吞噬能力、提高血液淋巴细胞转化，并促进肠道s t g a 的分泌，强化黏膜免疫瞄】。小麦面筋蛋白的谷氨酸含量丰富，来源广泛，被美国批准为公认的安全物质( g r a s ) 。因而酶解小麦面筋蛋白可以获得廉价的富含g i n 蛋白酶解物，为畜牧生产提供一种经济有效的g i n 替代物。1 4 , 3 谷氨酰胺活性肽在饲料中的应用1 4 3 1 谷氨酰胺在早期断奶仔猪营养中的应用早在8 0 年代养猪业就开始采用仔猪早期断奶，提高生产效率。由于仔猪断奶饲料的研究和管理技术的快速发展，早期断奶在工厂化养猪生产中基本缛到普及，断奶日龄从8 周龄缩短到3 周龄。早期断奶可使母猪泌乳期缩短，体重损耗减少，断奶后可及时配种，从而缩短了母猪的产仔间隔、有助于提高母猪的繁殖力；早期断奶亦可以防止因压死仔猪造成的损失，提高仔猪成活率 2 6 1 。尽管如此，早期断奶也带来了一个长期以来困扰人们的问题，即早期断奶常伴随有仔猪断奶后l - 2 周龄的生长停滞和腹泻( o k a 4 等1 9 7 6 ：a r m s t r o n g 和，1 9 8 0 ) ，常被称为“早期断奶应激综合征”( 将宗勇，1 9 9 4 ) ，通常表现为食欲不振、增重减缓、甚至体重减轻，且往往有不同程度的腹泻发生鲫嗍。国内外的营养学家对这一问题己做了大量的研究工作，并提出了许多解决措施和方法，包括对仔猪料进行酸化、加入外源性消化酶、使用易消化原料等，取得了不同程度的效果。w u 等【2 9 1 研究发现，母猪初乳和常乳中都含有丰富的谷氨酰胺。仔猪早期断奶后，肠道结构和功能变化可能受l 一谷氨酰胺利用率的影响，通过补充外源性谷氨酰胺可以加强刷状缘转运率，促进谷氨酰胺的净摄入，也可以通过刺激谷氨酰胺酶的活性支持粘膜生长。当母源谷氨酰胺的供应消失后，来自肌肉和血液中的内源性谷氨酰胺，不足以维持绒毛的完整性，添加合成的谷氨酰胺于仔猪日粮中提供了一种加强断奶仔猪肠道结8谷朊粉活性肽的酶鹪制取工艺研究构和功能的途径 3 0 l 。w u 等i 2 9 1 研究还指出，在泌乳第2 2 天和2 9 天的母猪乳中，谷氨酰胺是一种最丰富的游离和蛋白质结合的氨基酸，他们还测定了离体肠细胞谷氨酰胺的代谢，发蛋) l 2 9 日龄断奶仔猪与2 1 日龄的哺乳仔猪相比，肠细胞氧化谷氨酰胺生成二氧化碳的比率高2 1 0 倍。这些数据表明，对断奶仔猪小肠细胞而言，谷氨酰胺可能是更重要的能量底物。a y o n r i n d e 等用含4 谷氨酰胺强化传统的断奶仔猪谷物日粮，在断奶后第五天屠宰所有的猪，血浆中有很高的谷氨酰胺浓度，可以缓解绒毛萎缩，而且饲喂谷氨酰胺的仔猪其结肠和回肠d n a 含量和粘膜蛋白质含量增加1 3 。张军民等【3 3 】发现，每天于传统断奶仔猪日粮中添加约6 3 克游离谷氨酰胺，断奶后可保持与2 1 日龄哺乳仔猪相同的血浆和肌肉游离谷氨酰胺水平。有证据表明，在新生仔猪小肠粘膜感染的情况下，谷氨酰胺有利于维持正常的粘膜通透性。黄耀凌等1 1 9 1 究发现，谷氨酰胺对仔猪早期断奶应激有抵抗作用。皮质醇激素是动物应激时重要的反映指标，断奶仔猪灌喂谷氨酰胺后，血清中皮质醇的浓度显著低于对照组。有研究报道2 3 周龄早期断奶仔猪与正常哺乳仔猪相比表现出显著的免疫抑制f 3 2 1 ；黄耀凌掣1 9 研究还发现，灌喂谷氨酰胺后，断奶仔猪的免疫抑制得到改善。同时，补充外源性谷氨酰胺对早期断奶仔猪生长有一定的促进作用。张军民等在2 0 0 2 年研究了谷氨酰胺对饲喂生大豆仔猪肠道通透性和消化吸收能力的影响0 4 。谷氨酰胺对饲喂生大豆造成损伤仔猪的氮代谢有明显的影响，并可促进水分的吸收，减少腹泻的发生1 3 4 】。张军民，高振川等2 0 0 1 年研究日粮添加谷氨酰胺对早期断奶仔猪小肠酶的影响的试验。日粮添加谷氨酰胺可增加肠道亮氨酰氨基肽酶的活性，对乳糖酶和碱性磷酸酶活性无明显的影响【3 5 】。w u ( 1 9 9 6 ) 在2 1 日龄断奶仔猪的玉米豆粕型日粮中添加1 的谷氨酰胺后发现断奶后第一周可防止仔猪空肠绒毛的萎缩，第二周可提高仔猪的饲料转化效率【3 6 】。刘涛( 1 9 9 9 ) 实验发现，在断奶后第一周内添加谷氨酰胺可以改善2 8 日龄仔猪的平均日增重，降低腹泻率，但在第二周并未显著改善饲料转化效率。谷氨酰胺在促进由于断奶而引起的受损肠道的修复以及维持正常的局部免疫功能中发挥重要的作用。随着养猪生产集约化的不断扩大，仔猪早期断奶也愈加重要，在断奶仔猪日粮中添加适量的谷氨酰胺，对养殖业生产具有重要意义。谢新民研究发现，添喂谷氨酰胺后，实验组仔猪血清中胃泌素含量极显著高于对照组仔猪。胃泌素可以促进胃壁细胞分泌盐酸，提高仔猪胃内酸度，改善胃内环境，促进胃蛋白酶原向胃蛋白酶的转化，提高胃内容物胃蛋白酶活性 3 s l ；同时，添喂谷氨酰胺的实验组仔猪胃底腺和十二指肠绒毛长度显著增加，增加了仔猪消化道消化吸收的面积，很大程度上提高了胃肠道的消化能力，可以减少断奶仔猪由于胃蛋白酶活性低，大量未完全消化的物质在肠道后段堆积发酵而造成的营养性腹泻，降低断奶仔猪的死亡率。同时，补充谷氨酰胺有利于保9河南工业大学硕士学位论文护肠黏膜的快速生长；而且补充谷氨酰胺可以为胃肠道黏膜的生长提供能量肠道中谷氨酰胺代谢的另一个重要途径是合成瓜氨酸，可以防止由于瓜氨酸合成受阻导致严重的代谢障碍【3 0 】；同时在谷氨酰胺的代谢中，合成鸟氨酸也是一个重要的代谢途径，因为鸟氨酸可经过一系列酶促反应生成对肠道十分重要的一种生物活性物质多胺。多胺是一种脂肪胺类，广泛存在于一切生物体内，对动物肠道细胞的增殖和损伤修复有重要作用 3 9 1 ；谷氨酰胺还可以为核酸和蛋白质的合成提供胺氮 4 0 j ；谷氨酰胺可以合成谷胱甘肽( g s i ) ，g s h 在维持细胞的结构方面也起着很重要的作用【3 3 。谢新民研究还发现添喂谷氨酰胺后，仔猪血清中c k 活性实验组显著高于对照组；g p t 的活性有所提高，但无差异显著性。谷氨酰胺对断奶引起的十二指肠脂肪酶和淀粉酶活性的下降没有改善作用，这可能是母猪乳中乳脂的含量很高，而断奶后饲料中乳脂含量降低，底物的变化引起了脂肪酶活性的降低，淀粉酶活性的降低与其自身的发育特点密切相关。1 4 3 2 谷氨酰胺在肉鸡营养中的应用谷氨酰胺是血液循环和体内游离氨基酸池中最丰富的氨基酸，在细胞中其浓度也相对较高【4 1 1 。谷氨酰胺在细胞和组织培养中的重要性以及在动物体内的生理作用，已成为动物营养学研究的热点。越来越多的研究表明，在疾病、疲劳、断奶应激或热应激等高分解代谢状态下，机体对于营养物质的需求增加，以便产生更多的能量供机体对抗应激原的强烈刺激，而在此情况下，机体合成的谷氨酰胺不能满足各组织器官对谷氨酸胺的需求，血浆中谷氨酰胺浓度都比较低【4 2 】。因此，补充一定量的谷氨酰胺可以减缓血浆中谷氨酰胺的快速耗竭【捌。谢新民在肉鸡饲料中补充谷氨酰胺，发现在急性热应激时能够维持肉鸡血浆中比较高的谷氨酰胺浓度，这与黄耀凌博士u 9 j 在2 1 日龄断奶仔猪上的实验结果相一致，虽然随着急性热应激时间的延长，肉鸡血浆中谷氨酰胺的浓度逐渐下降，但补充谷氨酰胺的实验组肉鸡血浆中谷氨酰胺的下降趋势相对平缓，这对维持急性热应激条件下肉鸡相对正常的代谢活动有非常重要的作用。日粮中添喂谷氨酰胺还可以使肉鸡腹腔巨噬细胞的吞噬活性在较短的时间内迅速得以表现，缩短了因急性热应激引起的免疫抑制时间，使动物机体很快启动机体的非特异性免疫反应，产生免疫应答。同时研究表明在饲料中添加谷氨酰胺能有效降低急性热应激初期肉鸡的死亡率。随着急性热应激时间的延长，机体内部形成新的稳态体系，实现对应激原的代谢适应。戴四发等2 0 0 1年的研究表明在仔鸡早期生长时期补充适宜的谷氨酰胺有利于提高仔鸡的日采食量、日增重和饲料转化效率，这可能是因为谷氨酰胺是肠道利用最多的氨基酸，并且作为主要的能源物质用于维持依赖于a 1 1 p 的许多代谢过程的顺利进行田l 。1 4 3 3 谷氨酰胺在水产养殖中的作用谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究目前有关谷氨酰胺对断奶仔猪和禽类营养及生产性能方面的研究比较多，但有关其在水产养殖中的报道还比较少。水产动物不同于畜禽等单胃动物和反刍动物，因此水产动物对营养物质的需求、消化、吸收与利用等方面都具有其特殊性。首先在能量需求方面，鱼类属于低等变温脊椎动物，其维持体温所需要的能量消耗比畜禽少，且代谢产物主要是氨态氮，这种代谢形式比畜禽代谢产物主要是尿素和尿酸的耗能少，另外由于水的浮力大，鱼类在水中保持身体平衡所消耗的能量也要少。因此，鱼类对能量的需求比畜禽要低，且这些能量来自蛋白质的分解代谢；在能量代谢方面，鱼类的淀粉酶活性很弱，不能利用碳水化合物作为机体的主要能源，而只能以饲料中的蛋白质为能源，通过大量氧化氨基酸为肌体生长提供能量；在蛋白质代谢方面，鱼类对饲料蛋白质的要求一般在4 0 左右，有的肉食性鱼类高达6 0 ，远远高于畜禽日粮中2 0 以下的蛋白质含量。在消化系统方面，鱼类消化道只有畜禽的i 3 i 5 ，食物在消化道内停留的时间短，消化腺也欠发达，消化酶因体温低而活性也不高。并且鱼类肠道中起消化作用的细菌种类和数量都比较少。综上所述水产动物在各方面的特殊性，因此为鱼类提供易消化吸收和利用的蛋白质原料是水产营养中的核心内容。鉴于以上两方面的原因，越来越多的营养学专家开始贯注小肽谷氨酸胺对鱼类生长的影响。姜俊( 2 0 0 5 ) 在鲤鱼饲料中补充外源谷氨酸胺，实验结果表明外源谷氨酸胺能够促进鲤鱼前中肠上皮细胞的增值和分化，有利于鲤鱼前中肠上皮细胞完整性的保持 4 3 1 ；林燕( 2 0 0 5 ) 在幼建鲤饲料中补充谷氨酸胺，研究结果表明添加谷氨酸胺对幼建鲤的成活率没有影响，但提高了饲料采食量和饲料利用率，使添加谷氨酸胺对幼建鲤增重有显著影响( p o 0 1 ) ，当饲料中谷氨酸胺含量从0 0 提高到1 2 时，增重极显著提高了1 9 ( p o 0 1 ) m 。研究还表明g i n 可以提高幼建鲤的消化吸收能力，主要是通过促进肠道生长发育、皱襞高度增高、消化道酶包括蛋白酶、脂肪酶酶活性升高从而增加消化吸收能力，使饲料利用率升高；g l n 可以引起幼建鲤疾病抵抗能力增加，这主要是非特异性免疫力和特异性免疫力增加有关。综上所述，谷氨酸胺具有促生长、调节免疫、抗应激、抗疲劳、抗感染、维持酸碱平衡等作用。然而，谷氨酰胺的溶解度低( 室温下，3 5 c ) 、加热不稳定，限制了谷氨酰胺的临床应用。在人医学临床上为了克服这个问题，应用谷氨酰胺二肽( 主要是甘氨酞一谷氨酰胺、丙氨酞一谷氨酰胺) 代替谷氨酰胺。但是谷氨酰胺二肽价格昂贵，又影响其在畜牧生产中的推广应用；谷蛋白中含有丰富的谷氨酰胺。从谷蛋白中水解分离谷氨酰胺小肽作为饲料添加剂，将推广谷氨酰胺在畜牧生产中有重要意义。1 5 实验的主要内容河南工业大学硕士学位论文本课题来源于河南省2 0 0 4 年科技攻关计划，是在本实验室前一阶段实验研究的基础上，进一步开展对谷朊粉进行酶水解研究。本试验选用胰蛋白酶、风味酶和复合蛋白酶进行水解实验。本次实验主要研究以下内容：1 ) 对谷朊粉的基本指标粗蛋白、水分、氨基酸组成、不同p h 下的溶解度进行分析。2 ) 对实验选用蛋白酶的酶活进行测定。3 ) 实验选用胰蛋白酶、风味蛋白酶，复合蛋白酶三种蛋白酶为水解用蛋白酶，以水解度作为评价指标。分别进行单酶和双酶组合水解，验证前一阶段实验得出的最佳的酶水解工艺条件，得到高水解度的小肽液。4 ) 用t r i c i n e s d s p ：a g e 凝胶电泳，测定水解产品成分的分子量的分布。5 ) 用反相高效液相色谱测定水解产品中谷氨酰胺的含量。6 ) 喷雾干燥法提取酶水解液中谷氨酰胺的工艺研究。谷朊粉活性肽的酶解制取工艺研究第二章谷朊粉的酶解工艺研究小麦面筋蛋白中脯氨酸的含量也很高，这导致面筋蛋白缺乏负电荷：另一方面，面筋蛋白中精氨酸、赖氨酸和组氨酸等能提供正电荷的氨基酸较少，所以从总体上看，面筋是一种缺乏带电氨基酸残基的蛋白质，这是导致面筋蛋白水溶性不高的原因。另外从等电点来看，面筋蛋白总的等电点在p h 7 0 附近。与酸或碱水解法相比旧 4 8 】，酶法水解具有条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、水解程度容易控制，特别是在营养成分的保留上，具有不可比拟的优点 4 6 1 。所以通过有限酶解的方法不失为一种有效的方法，酶解后使面筋蛋白肽链断裂，电荷密度增大，蛋白质结构发生变化。这些结构变化使疏水性氨基酸残基暴露，因而增加了表面疏水性，且伴随带电荷极性基团出现，使蛋白具有两亲性，提高了蛋白的溶解度。但一些蛋白酶对酰氨基有很强的破坏能力，可能破坏面筋蛋白中的谷氨酰胺。因而在大量制备富含谷氨酰胺结合肽之前，挑选合适的蛋白酶是必要的。研究表明，肽中非n 端鲥是有效的，为此要求产品中游离的g l n 及n 端g 1 n 越少越好。风味酶( f l a v o u r z y m e ) 是一种用于在中性或微酸性条件下水解蛋白质的真菌蛋白酶和肽酶的复合体，该酶有很强的氮肽酶作用，常用于增进和改善水解液的风味，能彻底的水解蛋白质。酸性蛋白酶兼具外切和内切酶的作用，水解过程也产生游离的g i n 。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶虽然是内切酶，但它们在水解过程中能水解酰胺基团，因而常用于蛋白的改性。本课题的最终目的是最大程度地获得富含g l n 的水解产物，因此所选用食品级的蛋白酶应该对酰胺基团没有水解或水解作用较小，以产生尽可能多的富含g i n 酶解肽。由本研究室已有的研究发现，胰蛋白酶、风味蛋白酶和p r o t a m e 复合蛋白酶是较温和的蛋白水解酶，对酰胺基团的水解作用较弱。他们以水解度为评价指标，实验证明这三种酶水解小麦蛋白效果比较好，对酰胺基的破坏比较小。本研究以谷朊粉为原料，采用胰蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶水解谷朊粉蛋白，同样以水解度【4 9 】、氮溶解指数【5 田为评价指标，以反应p h 值、加酶量、底物浓度、反应时间、温度为影响水解度大小的主要因素，验证这三种蛋白酶的单酶和双酶组合的最佳水解条件。2 1 材料与仪器2 1 1 主要原料与试剂河南工业大学硕士学位论文谷朊粉胰蛋白酶风味蛋白酶复合蛋白酶l 酪氨酸酪蛋白福林酚试剂2 1 2 主要试剂河南莲花味精集团北京诺维信生物有限公司北京诺维信生物有限公司( 1 0 0 0 l a p u g )北京诺维信生物有限公司( 1 5 a u 儋)第二军医大学正祥化学试剂研究室( 生化试剂)北京奥博星生物技术有限公司( 生化试剂)实验室自制盐酸、乙醇、硼酸、乙醚、甘油、硫酸铜、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠溴甲酚绿、浓硫酸、醋酸、氢氧化钠、三氯乙酸和硼砂( 以上实验试剂