（作物遗传育种专业论文）水稻Sp1+11互作基因的克隆与功能鉴定.pdf

湖南农业大掌博士掌位论文 水稻 1 1 1 互作基因的克隆与功能鉴定 水稻s p l l1 互作基因的克隆与功能鉴定 摘要 水稻假病斑基l 司s p m ( s p o t t e dl e a f l l ) 能通过泛素降解作用，负调控细胞坏死 及假病斑的形成。s p l l l 突变体在自然条件下形成假病斑，从而提高对稻瘟病菌 和白叶枯病菌的抗性。为确定参与s p l l l 基因调控抑制细胞死亡和防御反应过程 的物质，本研究通过酵母双杂交体系，以s p l l1 为诱饵，筛选水稻c d n a 文库， 获得了8 个互作蛋白s p i n s ：s p i n l s p i n 8 。除s p i n 6 外，所有蛋白均与s p l l l 之 间存在中度或强烈相互作用。b l a s t 同源蛋白功能分析结果表明，s p i n l 编码一 个含k h 的r n a 结合蛋白；s p i n 2 基因，编码一个球蛋白重链；s p i n 3 编码一个 类m o m 蛋白，可能与维持转基因沉默有关；s p i n 4 编码一个含有r p r 2 r p p 2 i ( r p r ) 域的r n ap 酶蛋白，s p i n l 和s p i n 4 均与m r n a 的前体剪接功能有关。s p i n 5 编码 一个类乙酰谷氨酸激酶蛋白；s p l n 6 编码一个r h o - g t p 激酶蛋白；铲矾r 7 和s p l n 8 未检索到相关功能。 本研究中我们分别构建了s p i n 3 、s p i n 4 ，s p l n 6 基因的r n a i 及超表达载 体，并对功能进行了鉴定。通过遗传转化及p c r 鉴定共获得了多个阳性后代： s p i n 3 转基因r n a i 阳性后代4 1 个株系，超表达阳性后代6 个株系；s p i n 4 转 基因r n m 阳性后代1 个株系，超表达阳性后代2 个株系；s p i n 6 转基因r n a i 后代4 6 个株系，超表达阳性后代9 个株系。对阳性后代进行白叶枯病菌和稻瘟 病菌抗性功能鉴定发现，r n a i 株系中，仅s p i n 4 后代对白叶枯病菌抗性增强； 而超表达株系中，s p i n 3 ，s p i n 6 后代均对白叶枯病菌抗性增强，且s p i n 3 后代 对部分稻瘟病菌抗性增强。另外，研究中还发现s p l n 3 超表达后代p a l 酶活性 高于野生型和r n a j 株系。研究结果表明，s p i n 3 ，s p i n 4 和s p i n 6 基因极可能 参与了s p l l l 介导的泛素降解途径，但基因的确切功能还需在后代中作深入、 详细研究。 关键词：水稻、酵母双杂交体系、s p l l l 、s p i n 、r n a 干扰、超表达、稻瘟病、 自叶枯病 湖南农业大掌博士掌位论文 水稻 1 1 1 互作基因的克隆与功能鉴定 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f 硒c eg e n e s i n t e r a c t i n gw i t hs p l l1 a b s t r a c t s p l l1 i san e g a t i v er e g i l l m o ro fc e l ld e a t ha n dd e f e n s er e s p o n s ei nr i c e i t e n c o d e sau - b o xe 3l i g a s et h a ti si n v o l v e di n u b i q u i t i n a t i o n - m e d i a t e dp r o t e i n d e g r a d a t i o n t oi d e n t i f yp u t a t i v es u b s t r a t e so ft h es p l llp r o t e i n , w ep e r f o r m e da y e a s tt w o - h y b r i d ( y 2 哪s c r e e n i n gu s i n gt h es p l ll 堰mr e p e a td o m a i na st h eb a i t e i g h td i f f e r e n ts p l l1i n t e r a c t i n gp r o t e i n so rs p i n s ( s p i n l 一s p i n s ) w e r ei d e n t i f i e d e x c e p tf o rs p i n 6 a l lp r o t e i n sh a v ei n t e r m e d i a t et os t r o n gi n t e r a c t i o n s 、析t hs p l ll s a r md o m a i n s p i n le n c o d e sak h o m o l o g ( k h ) d o m a i n - c o n t a i n i n gr n a b i n d i n g p r o t e i n s p i n 2e n c o d e sah o m o l o go fp l a n tm y o s i nh e a v yc h a i np r o t e i n s p i n 3 e n c o d e sam o m - l i k ep r o t e i n s p i n 4e n c o d e sa nr n a s epr p r 2 r p p 2 1 ( p a r ) d o m a i n - c o m a l n i n gp r o t e i nw i t hp u t a t i v ep r e - m r n ac l e a v a g ef u n c t i o n s p i n 5 e n c o d e sa na c e t y l e 丑u t a m a t ek i n a s e - l i k ep r o t e i n s p i n 6e n c o d e sar h o - g t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n t w oo ft h es p i n s ，s p i n 7a n ds p i n 8 ，s h o wn oh i t st ok n o w n f u n c t i o n a lg r o u p su s i n gt h eb l a s t a l g o r i t h ms e a r c h a m o n g t h es p i ng e n e s , s p l n 3 , s p i n 4 , s p i n 6w e r es e l e c t e df o rf u n c t i o n a l a n a l y s i s r n a ia n do v e r - e x p r e s s i o nc o n s t r u c t sw e r eg e n e m t e x lf o rt h et h r e eg e n e s f o r t y - o n el i n e so f s p i n 3 一r n a i ，s i xl i n e so f s p i n 3 - o v e r e x p r e s s i o n , o n el i n eo f s p i n 4 - r n a i ，t w ol i n e so fs p i n 4 - o v e r e x p r e s s i o n , f o r t y - s i xl i n e so f s p i n 6 - r n a ia n d n i n el i n e so f s p i n 6 - o v e r e x p r e s s i o nw e r eo b t a i n e da n dc o n f 砌c dt oc a r r yt h e t r a n s g e n e s s i l e n c i n ga n do v e r - e x p l ：；i o no f t h et a r g e tg e n e sw e r ev e r i f i e du s i n gp c i l d i s e a s er e s i s t a n c eo f t h e s el i n e st ot h eb l a s tf u n g u sm a g n a p o r t h eo r y z a ea n db a c t e r i a l b l i g h tp a t h o g e n x a n t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a e ( x o o ) w e r ee v a l u a t e d a m o n ga l lt h e r n a il i n e s o n l ys p i n 4r n ml i n e ss h o w e dd l h a l l c e dr e s i s t a n c et ox o o i n c o n t r a r y , o v e r - e x p r e s s i o no f t h es p l n 3a n ds p n 6g e n e si nt r a n s g e n i cr i c ec o n f e r r e de n h a n c e d r e s i s t a n c et ox o o i na d d i t i o n ，w eo b s e r v e dt h a tt h ep a l a c t i v i t yi nt h es p l n 3 o v e r - e x p r e s s i o np l a n t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nt h ew i l dt y p ea n dr n a i p l a n t s c o 璐i g 吣n t 、 ，i t l lt h e i re n h a n c e dr e s i s t a n c et ox o o t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t s p i n 3 , s p i n 4a n ds p i n 6m i g h tb ei n v o l v e di nt h es p l l l 一m e d i a t e dc e l ld e a t ha n d d e f e n s ep a t h w a y m o r ed e t a i l e da n a l y s i so f t h et r a n s g e n i el i n e sg e n e r a t e df r o mt h i s s t u d yi sb e i n gc a r r i e do u tt oi d e n t i f yt h ee x a c tf u n c t i o no f t h e s eg e n e si nr i c e k e y w o r d s ：r i c e ；y e a s t t w o - h y b r i d ；s p l l l ；s p i n ；r n a i n t e r f e r e n c e ；o v e r e x p r e s s i o n ； m a g n a p o r t h eo r y z a e ；x a n t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a e 湖南农业大掌博士掌位论文 水稻s p l l l 互作基因的克隆与功能鉴定 缩写词 缩略词英文名称 中文名 2 4 - d 2 m e 5 f o a 6 - b a a b a a m p a m v r t a s 册 b a c b p b s a c a l 订v 3 5 s c d n a c e f c 1 ： b c t d c o - i p d d a b d d h 2 0 d e p c d m s o d ，呼 d n a d n a a d d n a b d d n t p s d t t d u b e b e c o l i e d l a e l i s a e m s g 盯 2 ，4 - d i c h l o r o p h e n | x y a e e t i a c i d 2 - m e r c a p t o e t h a n o l 5 - f l u r o o r o t i ca c i d 6 - b e n z y l a d e n i n e a b s c i s i ca c i d a m p i c i l l i n a v i a n m y e l o b l a s t o s i s v i r u s r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n a s e a c e t o s y d n g o n e a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e b a c t e r i a la r t i t i c i a lc h r o m o s o m e b 批p a i r b o v i n es e r u m a i b u m i n p r o m o t e ro f c a i i f l o w e rm o s o i cv i r u $ c o m p l e m e n t a r yd n a c e f t r i a x o n e c e t y l t r i m e t h y l a m m o ll o n i u mb r o m i d e c a r b o x y - t e r m i n a id o m a i n c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n d a y 3 3 - d i a m i n o b c n z i - d i n e - h c l d i s t i l l e da n dd c i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i m e t h y l s u l p h o x i d e n n - i m e t h y lf o r m a m i d e d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d a c t i v a t i o nd o m a i n d n ab i n d i n gd o m a i n d o o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e s d i t h i o t h r e i t o i d e u b i q u i t i n a t i n ge n z y m e e d h i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o h d i s o d i u me t h y l e n d i a m i n e t e t r a c e t a t e e n z y m el i n k e dl m m u n o s o r b e n t a s s a y e t h y lm e t t h a n e - s u l f o h a t e g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s ep u i i - d o w n 2 ，4 - 二氯苯氧乙酸 2 一巯基乙醇 5 氟乳清酸 6 - 苄基嘌呤 脱落酸 氨苄青霉素 禽成髓细胞病毒逆转录酶 乙酰丁香酮 腺苷三磷酸 细菌人工染色体 碱基对 牛血清蛋白 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 互补d n a 头孢曲松钠 十六烷基三乙基溴化铵 羧基末端结构域 免疫共沉淀 天 联苯胺 重蒸水 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 n ，n 一二甲基甲酰胺 脱氧核糖核酸 转录激活结构域 d n a 结合功能域 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏塘醇 去泛肽酶 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 酶联免疫 甲基磺酸乙酯 谷胱甘肽s - 转移酶作用 p u l l - d o w n 鱼型!旦受也! ! 翌! l 塑!臣耍垄焦蔓堕鳖 湖南农业大学博士掌位论文 水稻s p l l l 互作基因的克隆与功能鉴定 h h p t h y g i a a i p t g k a c k a n k b k t l b l i a c m i n m r n a m s n a e 【) 1 a n a a n a a c o d o r f p a l p b s p c r 鼬f r n a r n a i r n a s e a f p i n r t - p c r s d s s e c s s c s t e t d n a t e i r i s u b i u a s h o w h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e h y g r o m y c i n l n d o l e a c e t i c a c i d i s o p r o p y l t h i o - b d - o a l a c t o s i d e i ( a l i u ma c e 切l e k a n a m y c i n k i l o b a s ep a i b k i l o d a l d o n k i n e t i n l u r i a - b e x t a n im e d i u m m l i t h i u ma c e t a l e m i n u t c m e s s a g er n a m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m e t h g i e n e d i a m i n e t e t r a a c e f i ca c i dd i s o d i u ms a l t n a p h t h a l e n e a c e t i c a c i d s o d i u ma c e t a t e o p t i c a ll x m s i r y o p e nr e a d i n gf r a m e p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e p h o s p h a t eb u f f e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i f a m p i c i n r i b o n u c l e i c a c i d r n ai n t e r f e r e n c e r i b o n u c l e a s e a r e v o | m k m sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n m r i 甜0 1 1p c r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s e c o n d s o d i u mc i t r a t e s o d i u mc h l o r i d eb u f f e r s o d i u mc h i o r i d e t r i s h c l e d l ab u f f e r t r a n s f e r r e dd n a 砸s h c l e d 嘎ab u f f e r t r i s h y d r y x y m e t h yl a m i n o m e t h a n e u b i q u i t i np r o m o t e r u p s t r e a ma c t i v a t i n gs e q u e n c e 小时 潮霉素磷酸转移酶基因 潮霉素 吲哚乙酸 异丙基b - m 硫代半乳糖苷 醋酸钾 卡那霉素 千碱基对 千道尔顿 激动素 l b 培养基 醋酸锂 分钟 信使r n a m s 培养基 乙二胺四乙酸二钠 萘乙酸 醋酸钠 光密度 开放阅读框 苯丙氨酸解氨酶 磷酸缓冲液 聚合酶链式反应 利福平 核糖核酸 r n a 干扰 核糖核酸酶a 转，分钟 反转录p c r 十二烷基硫酸钠 秒 柠檬酸钠氯化钠缓冲液 n a c l ，t r i s c l e d t a 缓冲液 转移d n a t 6 s h c i ，e d t a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 泛素遍在蛋白化启动子 上游激活序列 x - g a l5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 i n d o l y l - d - g a l a c t o s i d e 5 - 溴4 氯- 3 一吲哚争口半乳糖苷 x 量!造型曼型翌生磐! ! ! 匹! 堡竺! i i ! 巴翌撞薹董 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：间：2 0 0 7 年1 2 月1 2 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 髫咐 彦班 时间：2 0 0 7 年1 2 月1 2 日 时间： a 年f z 月f 参日 湖南农业大掌博士掌位论文 水稻s p l l l 互作基因的克隆与功能鉴定 第一章前言 酵母双杂交体系( y e a s tt w o - b y b r i ds y s t e m ，y 2 h ) p 是发现和研究在活细胞体 内蛋白质与蛋白质之间相互作用的强有力方法之一，也是发现新基因的主要途 径。r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 伫堤一种简单、高效、大规模、高通量的 功能基因组学研究新方法。以大规模分离、鉴定基因组序列功能为特征的水稻功 能基因组研究必须依托于农杆菌介导的水稻遗传转化体系。水稻假病斑基因 印，j ( s p o t t e dl e a f1 1 ) ，是植物细胞死亡和防御反应的负调控因子【3 】，对稻瘟病和 白叶枯病有一定的抗性。本章分别对酵母双杂交体系、r n a 干扰、农杆菌介导 的遗传转化体系进行了综述。 1 1 酵母双杂交体系 蛋白质蛋白质问相互作用是细胞生命活动的基础和特征。酵母双杂交体系 是在真核模式生物酵母中进行，研究活细胞内蛋白质相互作用，并对蛋白质之间 的微弱、瞬间作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，是一种具有 很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术体系。 1 t 1 酵母双杂交的原理 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。许多真 核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开、功能上相互独立的结构域 ( d o m a i n ) 组成。例如酵母转录因子g a l 4 可分为两个独立的结构域：d n a 结 合功能域( d n ab i n d i n gd o m a i n , d n a d b ) 和转录激活结构域( d n aa c t i v a t i o n d o m a i n , d n a - a d ) 。这两个结合域分开时仍分别具有功能，但不能激活转录 g a l 4 ；只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈 现完整的g a l 4 转录因子活性，并可激活上游激活序列( u p s t r e a ma c t i v a t i n g s e q u e n c e ，u a s ) 的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 1 1 2 酵母双杂交体系的优缺点 1 1 2 1 优点 酵母双杂交体系能快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用、分离新的与已 知蛋白作用的配体及其编码基因【4 l 。其体系检测蛋白问相互作用具有以下优点： 第一，作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。第二，检测在活细胞内进行，可以在一定程度上 代表细胞内的真实情况。第三，检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因 而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。第四，融合蛋白基因在强 启动子作用下，处于较高表达水平。酵母双杂交体系采用不同组织、器官、细胞 类型和分化时期的材料构建c d n a 文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等 湖南农业大掌博士掌位论文 水稻 1 1 1 互作基因的克隆与功能鉴定 多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 1 1 2 2 局限性 酵母双杂交体系应用的局限性和存在的主要问题有：第一，双杂交体系分析 蛋白质相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如 糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和 功能依赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研纠5 1 。第二，酵母双杂交体系的一个重要问题是“假阳性”。由于某些蛋白本 身具有激活转录功能，可在酵母中表达时发挥转录激活作用使b d 结构域杂交蛋 白在无特异激活结构域的情况下激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白的 低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定复合物，从而引起报告基因表达，产生“假 阳性”结果。在筛选过程中遇到的假阳性可简单分成三型：i 型：表达单独的a d - y 融合蛋白即可激活转录。i i 型；表达a d y 融合蛋白和空b d 载体即可激活转录。 型：表达a m y 融合蛋白与任意b d 融合蛋白即可激活转录。部分假阳性来源 于筛选对象具有类似转录因子的功能，或在双杂交体系中能表现出这种特性。还 有一些可能与酵母中其他蛋白质作用有关嘲。因此，为排除假阳性，需要作严格 的对照试验。 1 1 3 酵母双杂交系统的建立和改进 1 1 3 1 酵母双杂交系统的建立 f i e l d s 掣1 1 人的工作标志着双杂交系统的正式建立。他们以与调控s u c 2 基 因有关的两个蛋白质s n f l 和s n f 2 为模型，将前者与g a l a 的b d 结构域融合，另 外一个与g a i a 的a d 结构域的酸性区域融合。由b d 和a d 形成的融合蛋白现 在一般分别称之为“诱饵”( b a i t ) 和“猎物”或靶蛋白( p r e y0 1 t a r g e tp r o t e i n ) 。如果在 s n f l 和s n 岔之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的b d 和a d 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应报告基因( r e p o r t e rg e n e ) 的转 录与表达。通过对报告基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物” 的两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此f i e l d s 等人采用编码b 一半乳糖苷酶的 l a c z 作为报告基因，并且在该基因的上游调控区引入受g a i a 蛋白调控的g a l l 序列。这个改造过的l a c z 基因被整合到酵母染色体u r a 3 位上。而酵母g a l 4 基因和g a l s o 基因( g a 船o 是g a l 4 的负调控因子) 被缺失，从而排除了细胞内源 调控因子的影响。已经知道在s n f l 和s n f 2 之间存在相互作用。结果发现只有同 时转化s n f l 和s n f 2 融合表达载体的酵母细胞才有b - 半乳糖苷酶活性，单独转化 其中任何一个载体都不能检测出b 一半乳糖苷酶活性。 1 1 3 2 酵母双杂交系统的改进 近年来，双杂交体系的改进与提高主要体现在以下几个方面： 2 湖南农业大掌博士学位论文 水稻 1 1 1 互作基因的克隆与功能鉴定 第一，发展了酵母菌株的多重筛选机制。在酵母双杂交体系建立的初期阶段， 仅采用单一的b - 半乳糖苷酶作为报告基因，其表达亦不能十分严谨地加以控制， 容易产生一些假阳性。经过改造，带有额外报告基因h 1 s 3 1 7 的酵母细胞，只有当 h i s 3 被启动表达才能在缺少组氨酸的选择性培养基上生长。大多数双杂交系统 往往同时使用两个甚至三个报告基因。这些改造后的基因在启动子区有相同的转 录激活因子结合位点，因此可以被相同的转录激活因子( 如上述g a i a 蛋白) 激 活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。 第二，降低毒性作用。某些诱饵蛋白质x 或待筛选蛋白质y 在酵母中大量 表达时，可能对酵母产生一定毒性作用，如使酵母体内信号传导通路阻断，干扰 酵母中正常基因表达调控，使酵母细胞在选择培养基上不能生长等。针对这些异 源蛋白质对酵母生长的毒性作用，近年来在双杂交系统中主要改进是选用更加灵 敏的报告基因从而降低这些异源蛋白在酵母中的表达量，减轻这些异源蛋白质在 酵母中的毒性，如采用l e x a 酵母双杂交体系嗍。在该体系中，g a l a 的b d 区 段被原核生物的l e x a 蛋白质编码所取代，单纯疱疹病毒的8 8 个v p 编码区则 取代了g a l a 的a d 区段。 第三，非核内蛋白质作用系统。在酵母双杂交体系中，b d - x 与a d y 相互 作用都是建立在对r n a 聚合酶l i 激活的基础上。这意味着双杂交过程是在细胞 核内完成的。然而许多待研究的蛋白质是膜蛋白，它们需定位到膜上之后才能表 现正常的生物学功能，与其他蛋白质起作用。有些真核细胞蛋白在翻译后需加工 修饰如二硫键形成、糖基化、聚异戊二烯基化等。这些加工修饰在正常的细胞核 内不可能发生。因此根据需要有人又发展了新的双杂交系统。例如，a r o n h e i m 等 唧设计了一个s o s 蛋白介导的双杂交系统，也被作者称为s o s 恢复系统( s o s r e c r u i t m e n ts y s t e m ) 。人的鸟苷酸交换因子s o s 蛋白是一种胞质蛋白，而酵母的鸟 苷酸交换因子e d e 2 5 蛋白定位在内膜上，可将相关受体信号传导给r a s 蛋白。由 e d c 2 5 突变产生的一种温度敏感突变型细胞不能在3 6 条件下生长。但是，如果 s o s 蛋白可以通过某种方式被定位到酵母细胞内膜上，那么它在这种温度敏感突 变型细胞中因替代c d c 2 5 蛋白的作用，而使酵母恢复在3 6 条件下生长的能力。 在a r o n h e i m 等人设计的系统中，待研究的两个蛋白质分别与豆蔻酰基化信号片 段和s o s 蛋白融合，前一个融合蛋白定位于膜上，如果两个待研究蛋白质之间存 在相互作用，这将使s o s 也定位到膜上，从而可激活r a s 蛋白使酵母在3 6 下 生长。利用该技术a r o n h e i m 等人找到了c - j u n 的两个新的互作蛋白。 第四，转化效率的提高。双杂交鉴定过程中要经过两次转化，使得工作量相 当大。另外，酵母细胞的转化效率比细菌要低约4 个数量级。因此转化步骤就成 为双杂交技术的难点。b e n d i x e n i o 】等人通过酵母接合型的引用，避免了两次转化 湖南农业大学博士掌位论文水稻s p l l l 互作基因的克隆与功能鉴定 操作同时又提高了双杂交效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型： a 接合型和n 接合型，这两种单倍体之间接合能形成二倍体，但a 接合型细胞之 间或a 接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点，他 们将文库质粒转化a 接合型酵母细胞，“诱饵”表达载体转化a 接合型细胞。然后 分别铺筛选平板使细胞长成菌苔，再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上， 原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单 倍体细胞或虽然是二倍体细胞但b d 融合蛋白和a d 融合蛋白不相互作用的均被 淘汰。长出来的克隆进一步通过b 半乳糖苷酶活性进行鉴定。这项改进不仅简化 了实验操作，而且也提高了双杂交的筛选效率。 f r o m o n t - r a c i n e 等人【i i , 1 2 对此技术作了进一步改进。b e n d i x e n 等人是通过把 两种接合型细胞同时复印到一个平板上使之接合；而f r o m o n t - r a c i n e 则是把两种 细胞直接在滤膜上混合然后铺到选择性平板上，避免了烦琐的复印操作，使工作 效率进一步有所提高。他们以l o 种功能已知、与m r n a 前体剪接有关的蛋白质 作“诱饵一经过三轮共十五次筛选，共得到约7 0 0 个阳性克隆，并发现了已知剪 接因子与其他因子的相互作用，鉴定了一些新因子，建立了这个剪接途径与其他 代谢途径的联系。 h u d s o n 等人【1 3 】在进行酿酒酵母蛋白质组的研究分析工作时，进一步改进了 这一体系，使得操作过程可最大程度地自动化。他们把酵母所有的约60 0 0 多种 蛋白质开放读码框( o r f ) ，分别构建成与b d 和a d 基因融合的表达载体。两类 载体分别转化不同接合型酵母菌株。6 0 0 0 株分别表达不同的a d - o r f 即“猎物” 细胞在1 6 张3 8 4 孔微滴定板上培养，再取少许菌液点在只表达一种b d 融合蛋 白的细胞形成的菌苔上使两种细胞接合形成二倍体，然后按照常规双杂交技术 鉴定“诱饵竹和a d 融合蛋白是否发生相互作用。整个过程中微滴定板的使用也大 大提高了处理量。 第五，逆双杂交系统。在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中，还 需通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质问的相互作用。针对实际工作中的这种 需要，v i d a l 等【1 4 ，”1 人发展了逆双杂交系统( r e v e r s et w o h y b r i ds y s t e m ) 。其技术的 关键是报告基因u r a 3 的引入。u p s 4 3 基因在这里起到了反选择的作用，它编码 的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5 一氟乳清酸( 5 f o a ) 转化成对细胞有毒的 物质。v i d a l 等人通过改造在u r a 3 基因的启动子内引入g a l 4 的结合位点。这 个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互 作用激活u r a 3 基因的表达时才能生长。在含有5 - f o a 的完全培养基上“诱饵” 和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白，即与b d 或a d 融 合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用，u r a 3 基因不表 4 湖南农业大掌博士掌位论文 水稻 1 1 1 互作基因的克隆与功能鉴定 达，则细胞能在含有5 f o a 的完全培养基上生长。通过这种方法，v i d a l 等人筛 选到了转录因子e 2 f i 的突变物，这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白r b ， 但丧失了同另外一种称为d p i 蛋白的结合能力。其结果得到了体外结合实验的 验证。通过对这些突变蛋白基因测序，他们发现了新的e 2 f 1 同d p i 结合的位点。 1 1 4 酵母双杂交在蛋白组研究上的应用 酵母双杂交技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也 可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多研究领域 中有着广泛应用。 1 1 4 1 发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱 饵，在选定的c d n a 文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵 母菌株中可以分离得到a d - l i b r a t y 载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入 的c d n a 片段，并对该片段的编码序列在g c n c b a n k 中进行比较，研究与已知基 因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因新功能或多个筛选到的 已知基因之间功能相关的主要方法。例如：e n g e l e n d e r 掣16 】人利用酵母双杂交 c i o n t e c h m a t c h m a r k e rs y s t e m3 为操作平台，以神经末端蛋白a l p h a - s y n u c l e i n 为诱 饵蛋白，从成人脑c d n a 文库中发现了与a l p h a - s y n u c l e i n 相互作用的新蛋白 s y n p h i l i n l ，并证明s y n p h i l i n - 1 与a l p h a - s y n u c l e i n 之间的相互作用与帕金森病的 发病密切相关。 1 1 4 2 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联免疫( e l i s a ) 、免疫共沉淀( c o i p ) 技术都是利用抗原和抗体 间的免疫反应，研究抗原和抗体之间的相互作用。但它们都是基于体外非细胞的 环境中研究蛋白质与蛋白质问相互作用，而在细胞体内抗原和抗体的聚积反应则 需通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶d f r 与其 抗体s c f v 的反应中，抗体单链的三个可变区a 4 、g 4 、h 3 与抗原之间作用有强 弱差异。d ej a e g e r 等1 1 7 利用酵母双杂交技术，将d f r 作为诱饵蛋白，编码抗体 的三个可变区的基因分别被克隆在a d l i b r a r y 载体上，将b d - b a i t 载体和每种 a d - l i b r a r y 载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中 的表达活性，从而实现在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。 1 1 4 3 筛选药物的作用位点 对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相 互作用以达到治疗疾病的目的。为了研究两个蛋白间相互作用的结合位点，找到 影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，n e y s t a t 掣1 8 】人利用酵母双杂交技术和基 因修饰证明了a l p h a - s y n u c l e i n 的1 6 5 个氨基酸残基和s y n p h i l i n - 1 的3 4 9 5 5 5 个 湖角农业大掌博士掌位论文 水稻s p l l l 置作基因的克硅：与功能鉴定 氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治 疗药物的开发。 1 1 4 4 建立基因组蛋白连锁图 随着基因组研究计划的开展，以及m r n a 在不同组织器官、不同发育阶段 表达图谱的构建，蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。近来 较为引入注目的应用是酵母蛋白质相互作用的横向研究，以揭示多种细胞活动过 程中各控制因子问的联系，并进一步探明至今还不了解或了解很少的大约36 0 0 种酵母编码基因的功能。目前已经成功地完成一些小规模的蛋白质相互作用图 谱，如t 7 噬菌休( 5 5 种蛋白质) 【1 9 1 和部分真核细胞蛋白亚基等。但是若要 对酵母中总共约60 0 0 种蛋白质进行系统而可信的研究，在筛选方式的自动化 程度，数据的精确性，质量的可靠性等方面还需要技术上的进一步提高。 基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组测序和 序歹i j 分析发现了很多新基因和e s t 序列，h u a 等 2 0 1 人利用酵母双杂交技术，将 所有已知基因和e s t 序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白， 从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。这对于认识一些重要生命活 动，如信号传导、代谢途径等有重要意义。 酵母双杂交技术作为分析蛋白质相互作用的强有力方法之一，必将在其他许 多方面获得发展，如r n a 领域等。应用杂交系统虽可较好地解决蛋白质翻译后 修饰的问题1 2 l 】，但在今后工作中，需把杂合系统更完善的推广到比酵母菌更高等 的真核生物体内，以使蛋白质的加工、修饰及相互作用过程更接近于真实状态。 另外，构建酶母蛋白质相互作用图谱，利用酵母中与人类相类似的基因进行有关 病理学的分子生物学研究等工作也正在生机勃勃地进行着，这些问题的解决必将 为揭示细胞生命活动的规律奠定重要基础。 1 2r n 出技术 随着模式植物拟南芥、水稻等基因组测序的基本完成，基因功能的注释、基 因的表达调控和改造，以及基因间的相互关系将成为人们研究的热点。r n a i 是 普遍存在于动物和植物界的一种防御反应。运用r n a i 来诱导基因表达的沉默， 并制备基因功能缺失表型，使之成为一种简单、高效、大规模、高通量的功能基 因组学研究的有效新方法。已有许多综述描述了r n a i 作用 2 2 3 - 2 4 1 ，下文就双链 r n a ( d s r n a ，d o u b l es t r a n d e d r n a ) 介导的基因沉默特点、主要介导方法，及其在 植物功能基因组上的应用作综述。 1 2 1 植物中转基因沉