布病实验室技术培训.安.ppt

布病病原学及实验室诊断,陕西省CDC鼠布生防科安翠红,布鲁氏菌病,布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌侵入机体，引起传染变态反应性的人畜共患传染病。布鲁氏菌病简称布病。布鲁氏菌简称为布氏菌。,布病病原学及实验室检验,1,2,3,布氏菌的生物学特性,布氏菌的抗原及毒力,布病实验室检验,1.1布氏菌的发现,1887年英国军医Bruce首先从死于“马耳他热”的英国士兵的脾脏中分离出羊种布氏菌。,1.1布鲁氏菌的分类学位置,微生物分类学家将布氏菌归为布鲁氏菌属（Brucella），下分6个种19个生物型。,分类,羊种布氏菌（Bvr.melitensis）1，2，3型；牛种布氏菌（Br.abortus）1，2，3，4，5，6，7，9型；猪种布氏菌（Br.suis）1，2，3，4，5型；沙漠森林鼠种布氏菌（Br.neotemae）；绵羊附睾种布氏菌（Br.ovis）；犬种布氏菌（Br.canis）。,陕西省布鲁氏菌病病原学调查分析,自1952年起，在人畜间共分离出3个种233株布鲁氏菌，其中羊种菌227株，占总数的97.4%。牛种3株、犬种3株。1991年以前流行优势种型为羊1、2型，1996年后则为羊1、3型。陕西省是以羊型菌为主、牛、犬种布鲁氏菌病的混合疫区。流行优势种随时间推移发生了变化。,1.2形态和培养特征,布氏菌属的细菌是一组微小的球杆状的革兰氏染色阴性菌。柯氏染色，布氏菌染成红色，其他菌染成绿色或蓝色。宽0.30.6m，长0.61.5m。无芽孢、无鞭毛、无质粒、不形成荚膜。一般说来，羊种菌最小，牛种菌次之，猪种菌最大。,1.2培养特性,营养条件高，生长缓慢，生长所需温度为20-40，最适温度为37.通常要经过4-6天，有的甚至要经过20-30天（双相培养基）才能长出菌落。,1.3抵抗力,对物理因子的抵抗力对化学因子的抵抗力不同环境中的抵抗能力对抗生素的敏感性,不同温度对布鲁氏菌影响,对物理因子的抵抗力,布鲁氏菌对消毒剂的抵抗能力,对化学因子的抵抗力,不同环境中的抵抗能力,现已证明，布鲁氏菌对四环素最敏感，其次是链霉素，而对枯草杆菌肽、多黏菌素B、多黏菌素M素等有很强的抵抗力。,对抗生素的敏感性,布氏菌的抗原、毒力,2,布氏菌的抗原成分十分复杂，存在A、M、G成分。A对牛种布氏菌有特异性，M对羊种布氏菌有特异性，G为两种菌共有。还与多种细菌存在共同抗原，因而有血清交叉反应。布氏菌不产生外毒素，只产生内毒素，有致热、致炎作用，可导致休克。,从种上来说，羊种毒力最强，猪种和牛种次之，犬种的毒力很弱，几乎不引起人致病。,由于菌种毒力等因素的不同，患病后的临床表现也不完全一样。羊种布鲁氏菌的毒力最强,患者中毒症状严重，多有典型的发烧、多汗、头痛、虚弱、关节痛、肝脾及睾丸肿大等急性症状。猪种、牛种次之。犬种的毒力很弱，几乎不引起人致病。,布氏菌实验室检验,3,诊断布病的金标准。3.1.1实验室要求布氏菌的分离培养要在生物安全二级以上实验室中进行。布氏菌是高致病性病原微生物，从危害程度来说为第二类病原微生物。,3.1.2方法采样（采血）双相培养基菌株鉴定（菌落形态观察、涂片、染色、镜检布氏菌诊断血清玻片凝集试验）种型鉴定（CO2需要与否、H2S的产生的测定、染料抑菌试验、单项因子血清凝集试验、噬菌体裂解试验等等）,3.1.3布氏菌培养特性布氏菌是需氧或微需氧菌生长缓慢，尤其初代分离牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在5-10%CO2环境中培养新长出的菌落无色透明，光滑圆形，突起，均质，直径1-2mm液体培养均匀混浊，无菌膜粗糙型菌落较大，生长快,布鲁氏菌培养材料,3.1.4布氏菌培养检查材料人或动物的全血、动物流产胎儿（胎儿的肝脏、肺、胃内容物）动物脏器、动物胎盘、关节液、阴道分泌物等新鲜乳汁,布鲁氏菌的培养,3.1.5样品的采集血培养：急性期、体温反应明显和血清滴度高的病人，血培养阳性率高血培养阳性率与病期、体温反应、临床表现以及血清滴度等有关系骨髓培养：慢性期病人骨髓培养的阳性率比血液高从胸腔积液、脓肿和关节液、痰、乳、阴道分泌物流产胎盘中分离到布氏菌新鲜乳汁,布氏菌特异的油滴样菌落,布氏琼脂布鲁氏菌菌落,血平皿布氏菌菌落,布氏菌革兰染色,3.1.6布氏菌鉴定程序,分离培养纯分离传代玻片凝集初步鉴定，阳性血清、因子血清凝集H2S产生试验，CO2培养依赖试验噬菌体裂解试验染料抑菌试验PCR检测其他方法检测生化测定脂肪酸分析PFGE等,布氏菌噬菌体,我国1981年起从国外引进布氏菌分型噬菌体，对鉴定布氏菌有良好使用价值，可以将布氏菌鉴定到种目前使用的噬菌体有TbFiBK2WbRR/OR/C,噬菌体对布氏菌的裂解,羊种布氏菌噬菌体裂解,分离培养基,商用培养基布氏琼脂布氏肉汤制备培养基肝浸液琼脂血琼脂培养基胰蛋白眎琼脂培养基半固体培养基选择性培养基添加剂（多种抗生素）商品添加剂多粘菌素B杆菌肽放线菌酮制霉菌素注意：PH7.2，琼脂适量，适当容器,布氏菌培养鉴定,新方法的应用细菌生化鉴定系统PCR鉴定OMP31AMOS-PCR,双向血培养瓶,3.2.1血清学诊断的意义3.2.2针对布病进行的检验3.2.3血清样本的采集和保存,3.2.1血清学诊断的意义,人的布病诊断方法：综合性诊断（1）流行病学接触史：密切接触家畜、野生动物（观赏动物）、畜产品、布氏菌培养物等或生活在疫区内的居民（2）临床症状和体征（3）实验室检查：病原菌分离、试管凝集试验、补体结合试验、抗人球蛋白试验具备（1）、（2）和（3）项中的任何一项检查阳性即可确定为布病病人,3.2.2针对布病进行的检验,实验室检查阳性判定标准（1）病原菌分离：检出布鲁氏菌（2）试管凝集试验：1：100（+）及以上（3）补体结合试验：1：10（+）及以上（4）抗人球蛋白试验：1：400（+）及以上（5）虎红、平板凝集试验：出现可见凝集（6）皮内变态反应：皮试后24、48小时分别各观察一次,皮肤红肿范围有一次在2.2.厘米及以上（或.平方厘米及以上）,虎红、平板凝集试验和皮内变态反应供初筛试验用对已确诊的慢性病人和接种过菌苗的人，应以临床症状为主要依据，血清学试验效价高低，皮内变态反应强弱供参考,布氏菌的血清学诊断方法,试管凝集试验(SAT)虎红玻片凝集试验(RBPT)含巯基化物处理血清后的凝集试验（2ME试验）抗球蛋白试验(Coombs试验)补体结合试验(CFT)乳环凝集试验(MRT)酶联免疫吸附试验(ELISA)金标法荧光偏振方法（FPA）,3.2.2.1、虎红玻片凝集实验,原理：利用酸性带色的抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性，主要检查血清中的IgG类抗体。评价：简便快速、容易操作，适用于基层大面积检疫，容易出现假阳性，结果仅供参考，不能作为确诊依据。,布病虎红玻片凝集试剂,试剂与器材,虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂玻片、微量移液器、枪头。方法：在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，充分混匀，5min之内观察结果。结果判定：出现可见的凝集反应就判为阳性；否则就为阴性。评价：简便快速、容易操作，漏检率极低，适用于基层大面积检疫；容易出现假阳性，临床上需要借助SAT来确认。,注意事项,血清静止的温度和时间对实验结果有很大的影响，在一定的时间和温度范围内，防治时间越长，温度越高，假阳性率越低；患者空腹血清出现假阳性少；凡是试验中凝集颗粒不规则，大小不匀，片状或絮状，凝集不清澈者，一般为假阳性，否则凝集颗粒规则，大小均匀，凝集清澈者，一般与SAT结果相符，为阳性。,原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体产生特异性抗体，这种抗体可与相应的布氏菌抗原发生特异性结合，在电解质的作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也就是用已知抗原查未知抗体。,3.2.2.2、试管凝集试验,3.2.2.2、试管凝集试验,试管凝集试验阴性,布氏菌试管凝集阳性,布氏菌试管凝集抗原,器材与试剂,实验凝集抗原、被检血清、生理盐水移液器、吸管、凝集管、试管架、稀释抗原用的玻璃杯、37度温箱。方法：每份血清取9支小试管，放于试管架上。血清稀释稀释抗原后；加入抗原温育18-22小时室温放置2小时后观察结果比浊管配置,0.2ml血清,2.3ml盐水,0.5ml抗原,05ml弃去,1:1600,结果判定：根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程度（滴度），特别是50%清亮度（+）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。+液体完全透明，菌体成伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集。+液体近于完全透明，菌体成伞状沉淀，呈75%凝集。+液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈50%凝集。+液体不透明，管底有很不明显的伞状沉淀，呈25%凝集。液体不透明，无伞状沉淀。效价以产生50%凝集的血清最高稀释倍数为受检血清的效价。血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀浑浊，两种对照管成立，才可判定试验管，否则重做。人的诊断标准：1:100+为阳性，1:50+为可疑。,试管凝集实验的评价,实验室诊断标准之一滴度1100及以上或病程一年以上者滴度为150及以上为阳性特异好，实用性、敏感性强主要检查血清中的IgG和IgM，适合于急性期病人的诊断。缺点：有前带现象，有时出现假阴性结果；长生一定的交叉反应；出结果慢，需要两天,注意事项,受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不能超过10，采血后应于3-4日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。每份血清和抗原要有对照。个别血清会出现前带现象，建议多做几个管，多采用几个稀释度。,3.2.2.3、抗人球蛋白实验（Coombs）,原理：机体受布氏菌抗原刺激后可产生“完全抗体”和“不完全抗体”。不完全抗体可与相应抗原结合，但不出现可见反应。若将预测不完全抗体的人血清球蛋白作为抗原，注射于另一种动物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗IgG、IgA、IgM）的抗体，再将此球蛋白抗体加入到抗原与不完全抗体复合体中，即可出现可见反应。分为两个阶段:不完全抗体与相应抗原结合为不可见阶段抗原抗体复合物有抗球蛋白抗体凝集而形成可见反应评价：所查抗体主要是IgG、IgA；可以作为早期和追溯诊断；适用于亚急性和慢性病人；操作复杂，耗时长，一般不作为常规检查项目。,器材及试剂,试剂：试管凝集抗原、被检血清、抗被检对象的血清球蛋白抗体、生理盐水器材：普通离心机、温箱、1ml及10ml吸管。方法：试管凝集试验阶段抗球蛋白反应阶段吸取上项试验的可疑管和全部阴性管，4000转/分离心15分钟，反复洗涤3次。向各管中加入生理盐水0.5ml，混匀，再向各管中加0.5ml一定稀释度的抗球蛋白血清，将反应管置37温箱中20-22小时，取出室温放置2小时后判定结果。判定标准同试管凝集试验,对照,被检血清对照（被检血清+盐水）试管凝集抗原对照（试管抗原+盐水）抗球蛋白血清加生理盐水对照抗球蛋白血清加试管凝集抗原对照抗球蛋白血清加被检血清对照对照全部为阴性时，实验才有意义我国试行的用于诊断人布病标准1:400及以上滴度。,注意事项,在进行Coombs试验时，洗涤抗原很重要，如不认真洗涤，在抗原表面上吸附血清中的某些其他蛋白物质，会干扰下一步加入抗球蛋白血清的反应，掩盖真正结果。一般采用加入抗球蛋白血清1:20-1:50之间的稀释度。,评价,（1）布氏菌感染后，约在15天出现不完全抗体，3个月左右达到高峰。可持续一年左右。该实验可作为早期和追溯诊断。（2）该试验特异性较强，尤其适用于诊断亚急性和慢性病人，所查抗体主要为IgG、IgA类。（3）一般不作为常规项目，在试管凝集试验为可疑，患者又处于慢性期时，可考虑抗球蛋白试验予以诊断。,3.2.2.4、布氏菌补体结合试验,原理：绵羊红细胞和溶血素可以形成结合物，在补体的作用下，发生溶血。在反应体系中，他们作为指示系统，与布氏菌的特异性抗原、抗体复合物竞争结合补体。如果发生溶血，说明血清中没有特异性抗体，判为阴性，即不是布病患者。,评价：主要检查IgG类抗体，特异性强，适用于各型各期病人的诊断，准确性高，敏感性差，对慢性病人有漏诊现象，操作复杂，影响因素多，难以在基层推广。,补体试验的5种成分,补体溶血素绵羊红血球布氏菌抗原待检血清（以及对照血清）,补体结合试验注意事项,血清灭活恒温水浴箱结果的判读出现问题的分析,3.2.2.5、皮肤变态实验,原理：IV型变态反应，为细胞免疫。当机体受布氏菌抗原刺激后，导致T淋巴细胞致敏，致敏的T淋巴细胞再遇到相同抗原后进行分化、衍变、产生能释放各种淋巴因子的效应细胞。局部的变态反应就是各种淋巴因子综合作用的结果。方法：前臂内侧前1/3处，酒精消毒，皮内注射布氏菌素