酶的提取与分离纯化.ppt

酶工程,姜静jing_jiang1974QQ:1336754154生物制药教研室(A511),1,2,酶蛋白制备,发酵生产,知识回顾,3,第四章酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。纯化工艺评价,基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程,6,第一节酶的分离一、发酵液预处理目的：提高固液分离效率使产物转移用于后处理相中去除部分杂质(一)发酵液的相对纯化1.无机离子的去除2.杂蛋白质的去除3.色素及其他物质的去除,（降低离子强度、酶活性影响）,（沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附）,7,(二）发酵液的固液分离1.影响发酵液过滤的因素1）菌种2）培养基组成2.提高过滤性能的方法1）絮凝和凝聚2）稀释、加热3）加助滤剂，常用硅藻土等。,主要方法是离心分离和过滤,8,二、细胞破碎（胞内酶）（一）细胞壁组成细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌:多糖（几丁质和葡聚糖）,9,各种微生物细胞壁的结构与组成,10,细菌细胞壁的结构,酵母菌细胞壁的结构M甘露聚糖；P磷酸二酯键；G葡聚糖,12,（二）细胞破碎的方法,机械法机械捣碎法研磨破碎法匀浆破碎法高压匀浆法超声破碎法,非机械法酶法化学法物理法干燥法,13,1.机械法：1）液体剪切：搅拌、匀浆。2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。3）超声波破碎法。2.非机械法物理法1）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。2）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。,14,3.酶解法（enzymaticlysis）：外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。自溶法（autolysis）:细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。,15,4.化学法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。2）表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂，如TritonX-100，Tween等。,16,破菌,分离策略酶法+高压匀浆/超声盐及表面活性剂低浓度的变性剂,17,（三）细胞破碎确认1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。,18,三、酶的提取(extraction)把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。,19,提取目标：a.将目的酶最大限度地溶解出来。b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（010）操作。,20,提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。,21,提取方法：（一）盐溶液提取常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取,22,四、离心分离三种形式：1）离心沉降2）离心过滤3）离心分离和超离心,23,（一）基本原理1.离心力Fc=macmr2mr（2N/60）2N为离心机每分钟转数（r/min）；Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r此公式描述了相对离心力与转速之间的关系旋转半径用r平均代替r平均=1/2（r大+r小）cm,24,2.沉降系数:（sedimentationconstant）指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于许多生物大分子的S值很小，所以定义1013s为一个沉降单位，1S=11013s。常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1200之间。,25,（二）离心机的种类按离心机转速的不同，分为：常速（低速）高速超速,26,离心机的种类,27,实验室离心机,温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。使用超速离心机时先抽真空。,28,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。,29,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。,30,离心机的大小：落地式及台式,31,小台式离心机,32,离心管,材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖,33,离心机操作,平衡、定温、定速、定时。,34,（三）常用离心方法差速离心法沉降速度法密度梯度离心沉降平衡法等密度梯度离心,35,1差速离心（differentialcentrifugation）采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。2）沉降的颗粒受到挤压。,36,差速离心分离示意图（a）离心前的悬浮液（b）（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况,37,38,2密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。,39,特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。,40,密度梯度离心示意图（a）离心前（b）离心后,41,Densitygradientultracentrifugation,42,密度梯度离心,步骤：A.形成密度梯度B.加样C.离心D.收集样品,43,3.等密度梯度离心又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。,44,常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。特点：介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。,45,等密度梯度离心示意图（a）离心前；（b）离心后,46,沉降速度离心和沉降平衡离心的特点,47,48,（四）离心条件离心力:RCF=1.1210-5N2r离心时间:t=K/S*(最高立离心速度/所需离心速度)2K=(lnr2-lnr1)/2=(lnr2-lnr1)2.351011/n2温度和pH:,49,五、沉淀分离（根据溶解度的不同）,使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法,50,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：中性盐沉淀（盐析法）有机溶剂沉淀选择性沉淀（热变性和酸碱变性）等电点沉淀有机聚合物沉淀,51,（一）盐析沉淀法（改变离子强度）,1.基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。,52,蛋白质的盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐析,盐溶,53,原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。,54,蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域,55,56,57,1）中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点：a.溶解度大b.分离效果好c.不易引起变性d.价格便宜,2.盐析用盐,58,2)盐浓度的表示用饱和（溶解）度表示:溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度溶液的总体积,59,3)调整盐浓度的方式a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液,60,所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：S2-S1V=V01-S2式中V,V0分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度,61,b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据B(S2-S1)W=1-AS2A,B常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。,62,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,63,盐析操作,低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。,64,3.盐析曲线的制作如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力102030405060708090100硫铵饱和度,65,硫酸铵浓度（%）枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线,66,4.盐析的影响因素1)离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：,I：离子强度，I=MZ2；M：离子浓度（mol/L）；Z：离子价数S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。,67,当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用表示，盐析方程式可改写为：logS=-KsI两种盐析法：Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。分级盐析法：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。,68,69,2)蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等电点处最易沉淀。4)温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在04下操作。,70,（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1.沉淀机理降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。,71,3.优缺点：优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。,72,4.影响有机溶剂沉淀的因素（1）温度：低温（0）操作。（2）pH值：尽可能靠近其等电点。（3）离子强度：采用0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度目的防止蛋白质变性（4）蛋白质浓度：适当，一般为520mg/ml,73,（三）等电点沉淀(isoelectricprecipitation)1.原理蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点2.使用方法单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。,74,3.优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化4.缺点：酸化时，容易引起蛋白质失活,75,（四）有机聚合物沉淀法1.作用机理：与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。2.沉淀剂：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，简写PEG）多用分子量为600020000的PEG。3.优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。,76,（五）选择性变性沉淀法选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。pH变性等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。,77,六、萃取（extraction）分离利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点：1）比化学沉淀法分离程度高2）比离子交换法选择性好、传质快3）比蒸馏法能耗低,78,（一）溶剂萃取法明确几个概念：料液：供提取的溶液。溶质：料液中欲提取的物质。萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂。萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液。萃余液：被萃取出溶质后的料液。反萃取（backextraction）：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。,79,溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平衡规律）为基础。在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。萃取相浓度C1分配系数K0=萃余相浓度C2K0值随溶液pH的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。,80,普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，因为:1）蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂2）蛋白质在有机相中易变性失活故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。,81,萃取操作的3个步骤：1）混合2）分离3）溶剂回收,82,（二）双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术（partionoftwoaqueousphasesystem）用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%90%），故称“双水相”系统。,83,优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。,84,双水相的形成：两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。,85,86,几种典型的双水相系统聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羟丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素聚乙二醇（PEG）磷酸钾、硫酸铵硫酸钠、硫酸镁,87,2.萃取原理：利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。,88,3.应用胞内酶的提取和精制:除去细胞碎片，并使酶得到纯化。,89,几种典型的双水相萃取酶蛋白实例酶菌种相系统延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/盐天冬氨酸酶E.coliPEG/盐-半乳糖苷酶E.coliPEG/盐亮氨酸脱氢酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脱氢酶BakersyeastPEG/盐青霉素酰化酶E.coliPEG/盐,90,双水相萃取法的重要研究方向亲和萃取（亲和分配）使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分离选择性。,91,亲和萃取酶实例,92,（三）超临界流体萃取兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。超临界流体(supercriticalfluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点临界点后的流体。,93,（四）反胶团萃取1.反胶团：又称反胶束（ReversedMicelles）指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。,反胶团模型亲水基团向内聚集,94,95,2.萃取过程第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。,96,反胶团萃取原理,97,3.表面活性剂及有机溶剂反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。,98,（1）表面活性剂常用：AOT(AerosolOT)（阴离子表面活性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。（2）非极性有机溶剂环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。,99,4.优点1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。,100,酶的分离纯化,沉淀,粗纯化,精纯化（制）,上清,分离,101,第二节酶的精制（精纯化）,纯化原理（掌握）基本原则（掌握）纯化技术（掌握原理、选择依据）,102,纯化方法依据原理：溶解度、特异性吸附、电荷、分子大小酶纯化的基本原则：建立一个方便灵敏的分析方法(纯度、收率)；选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；选择适宜温度，保持酶活性以避免酶的变性；抗氧化失活（DTT,BME,EDTA,etc）；其他添加剂，防止酶失活。,第二节酶的精制（精纯化）,103,酶精纯化常用技术,膜分离技术柱层析技术蛋白质结晶,104,一、膜分离借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。,105,膜分离技术的分类,106,（一）扩散膜分离透析（dialysis）,溶质分子Y从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动,107,1.透析膜1）特点：多孔薄膜，允许小分子通过，阻止大分子通过；化学惰性，多种溶液中不溶解；（材料：纤维素衍生物）一定的机械强度；2）透析膜规格选择（表4.11-4.12）,108,2）透析膜的预处理：目的：除杂质。3）透析袋的保存：防腐剂冷藏。,109,蛋白质透析,110,2.透析方法及装置,透析袋透析简单装置。A:透析夹，B:透析，C:透析示意图,111,3.透析速度影响因素P164浓度梯度分子大小和形状温度膜表面积膜厚度,112,（二）超滤,依据被分离物质分子大小、形状和性质的不同，在外力作用下形成一定压力差，使溶液中物质在超滤膜表面发生分离，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。,113,1.超滤膜特点,非对称双膜结构，包括分离层和支撑层。超滤膜性能指标包括渗透通量和截留率。,114,2.超滤装置实验室装置,115,根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：,116,微滤(Microfiltration，MF)一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；,117,常规过滤(A)和超滤(B)的示意图,A,B,118,119,2.超滤装置工业装置,中空纤维系统,120,超滤膜包装置,2.超滤装置工业装置,121,3.超滤膜的选择及使用,截留分子量流速材质膜完整性清洗与保存,4.影响流速的因素溶质分子性质溶质浓度压力搅拌温度其他,122,色谱起源,色谱,组分,色素,石油醚,碳酸钙颗粒,用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)。,（二）柱层析技术,123,ColumnChromatography,124,层析柱的制备与层析操作柱层析的设备:层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。,125,层析设备,层析装置：梯度混和器蠕动泵层析柱监测仪记录仪收集器,126,记录仪,127,低温层析柜,128,129,现代化层析设备AKTA,层析柱XKBPG,130,现代化层析设备AKTA,131,记录系统,132,良好的线性放大,133,(一)凝胶过滤层析凝胶过滤（gelfiltration）又称分子筛层析（molecularsievechromatography）、排阻层析（exclusionchromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。,134,（1）.基本原理大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。,135,136,137,Size-exclusionchromatography,138,凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：Ve-VoKd=ViVo外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）,139,凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰.Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。.Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。.其它组分0Kd6.0蛋白质带正电,pI6.0蛋白质带负电,159,2.阴离子交换剂分离蛋白质的过程,平衡,吸附,去吸附,分离结束,再生,+,低盐,高盐,利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,160,Ion-exchangechromatography,161,3.操作平衡上样平衡洗脱再生1）上样：上样体积不十分严格。2）洗脱:增加溶液的离子强度梯度洗脱法改变溶液的pH值3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl处理。4.应用制备纯化生物大分子,162,图4-39梯度溶液的制备方法和洗脱曲线（a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度,163,影响离子交换层析的主要因素,PH离子强度层析介质（流速、分辨率）,164,（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）从分离纯化的机制看，属吸附层析类。利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。,165,大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心，欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobicpatch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。,原理:,166,在高盐浓度下，蛋白质发生局部结构可逆改变，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。,167,168,2.吸附剂亲水性（如Sepharose）基质固定相疏水性（如硅胶、树脂）配体（疏水性基团）（苯基、辛基、烷基）,169,一些商品疏水层析介质,170,3.操作1）加样：样品溶液中补加适量的盐。2）洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。3）再生：除去固定相吸附的杂质，用水或8mol/L脲素溶液。4.应用主要用于分离纯化大分子物质。,171,（四）吸附层析（adsorptionchromatography）1.原理利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。,172,173,吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。,174,2.吸附剂吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。1）吸附剂的选择：根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂：氧化铝、活性炭,175,2）吸附剂的性质：活性炭：强吸附介质，选择性差，除色素。硅胶：常用的极性吸附介质，有机小分子吸附。羟基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6.(OH)2:微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。吸附原理是HA的Ca2+与蛋白质的负电荷基团作用。分离纯化生物大分子：DNA（不高于10ng/人剂量），Protein,176,（五）亲和层析(AffinityChromatography)由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析（functionchromatography）生物专一吸附（biospecificadsorption）选择层析（selectivechromatography）,177,1.原理及特点（1）原理：将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一分子进行纯化。,（2）亲和层析特点分辨率高分离速度快操作简单对设备要求不高,亲和吸附剂通用性差洗脱条件苛刻,178,+,C,C,C,配基,蛋白质,1.配基固相化,2.亲和吸附,固体载体,3.解吸附,179,Affinitychromatography,180,2.基质的选择理想的基质应满足以下要求：高度的亲水性。极低的非特异性吸附性（惰性）。具有足够的化学基团。适当的多孔性。较好的理化稳定性。,181,可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose1B到10B,182,3.配体的选择一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。优良配体须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与基质共价结合的基团。,183,目的产物与相应的配基,184,当前常用亲和吸附介质的配基,酶底物（GST-GS）抗体（针对特定抗原）金属离子（Ni-NTA）ProteinA（吸附Ig的Fc部位）,185,4.偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体（基质）1）基质活化：不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。,186,溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基,187,2）引入连接臂（spacearm）又称手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B,188,189,常用手臂,190,5.操作：1）层析前：选择亲和层析剂选择根据欲分离物质特性配基选择根据配基分子大小及基团特性载体2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱,偶联,亲和层析剂,191,非专一性洗脱：改变温度改变pH值改变离子强度专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物）被吸附物质结合竞争性地与配体结合,192,6.应用1）纯化带“标签（tag）”蛋白如：带有His-tag，GST-tag蛋白纯化2)抗体及Fc融合蛋白纯化ProteinA,193,(六)反相层析高效（压）液相层析（HPLC常用于分析）,反相层析原理：同疏水层析，常用于高效液相层析特点：使用的固相支持剂颗粒很细（50）2.酶的浓度（恰到好处）浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。3.结晶温度4.溶液pH5.离子强度6.晶核7.结晶时间,244,（二）结晶的方法1.除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达到过饱和状态而析出晶体;2.不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，如中性盐、有机溶剂等。盐析法如，前述的有机溶剂法均可用于结晶等电点,245,常用的结晶方法：透析平衡结晶法将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）。酶液要浓缩到一定浓度。,246,第五节纯化方案的设计与评价,247,第五