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肉制食品中动物源性成分鉴别方法研究新进展 刘梦恬 （南京森林警察学院，江苏南京210023） 【摘要】食品安全问题是涉及民生的重大问题。当前，肉制品掺假造假现象较为普遍，严重扰乱市场秩序，危害人们健康。在肉类掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分鉴别的方法研究逐步成为食品安全领域的研究热点。由于食品中的肉类经过切碎、混合、蒸煮、熏烤等加工烹调过程后，失去了原有的形态学特征和质地，增加了品种鉴定的困难。 关键词肉制食品；掺假；动物源性成分；鉴别方法 0序言 民以食为天，食以安为先，食品是人类社会赖以生存的第一物质基础，而食品中肉制食品的消费比例一直在食品消费行业中占据十分重要的地位。因为肉制食品是人体蛋白质和微量元素的重要。但近年来全球的肉制食品安全状况实在令人担忧。20世纪以来疯牛病，禽流感、马肉风波、掺假肉、过分添加各种添加剂的事件层出不穷，暴露了严重的食品安全问题严重的威胁到了人类的生命安全。由于不同的肉制品其品质和价格均有差异，当前很多不法商贩以低价肉类代替高价肉类出售，不仅严重损害了消费者的利益，而且也从另一方面透露出食品安全的风险。为了更好的保障食品安全，目前已经研究出的肉制品掺假技术有16种左右，从先进程度依次有：以显微镜为基础的物理方法，以检测蛋白质为基础的免疫学方法，以检测DNA的分子生物学方法，以高效液相色谱技术的化学方法以及应用近红外反射光谱学的方法等。而目前最为常用的是高效液相色谱技术研究肉类掺假。 1肉制品中常见的掺假形式 对于近年来造成肉制品掺假的主要原因是商家为了谋取暴利而将廉价肉类掺入到价值较高的肉类当中。这是消费者当前最为担心和关注的一种肉制食品掺假形式。而实际上，对于肉制品的掺假形式并不只是单一的掺入廉价肉类，而是在其生产、加工过程中的任何一个环节都有可能出现掺假行为。根据有关报道将肉制品的掺假和欺诈的问题归纳为4类，分别为肉的、肉成分被替代、肉类在加工过程的改变以及非肉类成分的添加。而在我国市场存在的肉类掺假问题主要集中在将低价肉掺入到牛羊等高价肉种中。根据掺假方式造成恶劣程度可以分为三种情况。行为最为恶劣的是使用不明的非可食用肉类进行掺假，多见于流动摊贩。常见的掺假肉类有鼠肉、猫肉、狗肉等。其次是用可追溯的非可食用肉类进行掺假。主要涉及的肉类有马肉、狐狸肉以及貂肉等。而恶劣行为最为轻微的是用低价值的可食用肉类（如鸡肉、鸭肉、猪肉）掺入牛、羊肉中。火锅使用的羊肉卷是羊肉掺假形式最为严重的情况，消费者没有一定的经验和专业知识是很难将其从宏观上鉴别的。对于这一系列的掺假行为则需要相应的检测技术将其一一鉴别。 2动物源性成分鉴别方法 由于肉制品的掺假形式多种多样就决定了检测技术的多样性，才能保证每种掺假行为都有相应的检测技术对其真伪进行鉴别。常见的肉制品真伪鉴别方法包括：物理方法主要运用显微镜进行观察，基于蛋白质的检测方法如常用的免疫学方法，基于DNA的分子生物学的分析技术如PCR，实时定量PCR和基因芯片技术等，还有应用较有针对性的近红外反射光谱学的方法。 2.1基于显微镜观察的物理方法 以显微镜为基础的物理方法，是唯一一个被欧盟认可的检测肉制食品动物源性成分的官方方法，这项方法主要是检测动物的骨头组织，q区分陆地动物的肉制品和鱼制品。骨头是最常见的成分，在肉制品内也可能含有被粉碎的骨头，即使经过长时间高温煮熟也能被检测出来。利用此方法进行检测的关键是观察片状骨头薄片之间的空隙，不同种类的动物有不同的空隙形状，通过观察空隙的形状从而判断组织为何种动物。在低倍镜下主要观察沉淀物的一般结构和颜色是辨别不同肉类的第一步。动物的肌肉纤维一般没有各自特点，判定动物源性成分的重要依据是是否有动物肌肉纤维的出现。对于此方法，有经验的人告诉我们只有在理想的状态下才能够区分禽类和鱼类制品。虽然此方法对于检测肉类掺假的运用会便捷，简单且成本低，但由于理想状态的条件在现实生活中很难达到，也就成为此方法不能被广泛应用的原因了。 2.2基于蛋白质检测的免疫分析法 随着抗体技术的不断发展，肉类掺假使用的免疫检测技术大量出现。主要包括试管沉淀法，琼脂扩散法，放射免疫法，免疫组化，对流免疫对流法和酶联免疫分析法（又称ELISA技术）。其中应用最为广泛的是酶联免疫分析法。因为传统的免疫分析法以抗原与抗体特异性结合为基础，只能鉴别粗加工肉类，对于经过加工处理的肉制品而言，蛋白质发生了变性而使原来的抗原特性发生了改变，此时只有热稳定性的蛋白质标记物肌钙蛋白I才能例如用于检测。在研究次方法的学者中也取得了一定优秀的成果，例如：Macedo-Silva等通过制备抗牛、鸡、猪、马白蛋白的抗血清建立了ELISA方法用于鉴别单一样品和混合样品的成分，灵敏度可达0.6%。Chen等发展了以单克隆抗体建立的ELISA方法检测猪肉中的热稳定性肌肉蛋白，并且用该方法对原料和经过加工过的肉类和饲料中猪肉的含量进行定量分析。在不同的肉类混合物中猪肉的检测限为0.5%0.05%。虽说此方法已经得到了在某些肉制品掺假中起到了一定的作用，但是却仍有以下一些方面的不足：一是抗原抗体的特异性结合免疫分析法在亲缘关系较近的物种中容易出现交叉反应，且在加工肉制品中抗原的溶解特性和抗原表位都会相应发生变化；二是单克隆抗体虽然能大大的提高检测的特异性，但制备它的成本高且耗时长，在一些紧急条件需要检测的条件下十分的不适用。 2.3基于DNA的分子生物学方法（DNA分析法） 科技不断发展，基于DNA分子生物学检测肉制品真实性鉴别方法的研究也越来越多。较早的研究主要运用DNA杂交的方法，而目前则集中于以PCR为基础的各类分析方法，其中包括DNA测序、物种特异性PCR、实时定量PCR等。DNA分析法的应用原理为通过分析物种的基因组DNA或线粒体DNA序列差异进行鉴定。线粒体DNA相对于基因组DNA有更加独特的优势。主要由于线粒体DNA进化速度快和稳定性强的特性，每一个线粒体中有多个拷贝的线粒体DNA分子，适合用于扩增遗传变异，结构简单，分子量小，为16.5kb大多数为编码基因易于测序，线粒体DNA呈严格的母系遗传，在世代遗传过程中不发生重组，一个个体即代表一个母系集团，且线粒体的进化速度比核DNA快。线粒体基因组在不同的区域有不同的进化速度，因此可以选择合适区域进行研究。其中线粒体DNA的热稳定性和高效的拷贝数有助于DNA片段的保存确保有足够的模板进行PCR扩增。 2.3.1DNA分子杂交技术 DNA杂交技术是较为传统的DNA分析技术，它主要是通过碱基互补配对利用放射性同位素和标记元素等信号分子的特有的DNA片段识别与其互补得序列DNA。其外在表现形式为根据信号分子的强弱判断样品成分有哪些类别以及数量的多少。有学者已经运用此技术鉴别了加工肉制食品中的羊肉，兔肉，牛肉，猪肉等的源性成分，实现了半定量的测量。但是该方法检测效率低，操作繁琐，因此逐渐被兴起的PCR技术取代了。 2.3.2基于PCR的核酸扩增技术的方法 PCR技术是在DNA聚合酶的催化下，以DNA母链为模板，特定引物为起点，在体外复制出与母链模板DNA互补的子链的这一反复拷贝的过程。起到关键作用的是引物个探针的使用，从而决定了其适应程度的好坏。 常用的物种特异性PCR方法与其他PCR比较具有灵敏度高，简单，快速的优点。根据肉制品的组成成分为混合的这一特点，此方法运用起来十分方便，而在同一PCR反应过程中简单的物种数量有限的，则可以运用基因组DNA和线粒体DNA进行相应的物种鉴别。也有大量的研究人员在此技术上获得了成就主要有:Herman通过设计cytb基因的物种特异性引物成功地鉴别了食品中鸡肉、火鸡肉、猪肉、牛肉和羊肉成分。Piknova等利用cytb基因鉴别了牛源性成分。Kesman等通过设计线粒体DNA引物特异性检测加工肉肠中的猪肉、马肉和驴肉成分。对于此方法是否能用于商品化肉制品的掺假鉴别，只需关注两个物种混合样品中每个物种的检出限是否都能达到0.1%，若都达到，则表明这种方法可用于肉制品的掺假鉴别。 单一物种的PCR扩增方法是不能满足当代复杂多样的掺假肉制食品鉴定，因而又研究出了在同一PCR反应体系中采用多个引物对多个肉类物种进行同步，精确和快速检测。这便是多重PCR分析法该方法成本低、省时、高效，可对多种成分同时鉴别。 为提高鉴定的准确度、灵敏度、以及操作的简易化，将DNA杂交技术与PCR技术相结合用于肉制食品掺假技术的鉴别也成为研究热点。因此该方法操作简便，快速，筛选量大。还有最新研究的基因芯片技术，在肉制食品的掺假鉴别中，除了以上优点外还有对于样品的分析和确认可以提供大量的信息。其工作原理是是应用已知核酸序列与互补的靶序列杂交，从而根据杂交信号对待检测样品进行定性和定量分析。有德国公司研发的一种特殊的LED芯片分析试剂盒针对马、牛、羊、猪、鸡、鸭等十四种动物的线粒体16SrRNA特异性位点进行设计，检测和分析。该方法可检测低于0.5%的动物成分，从数据中可反应其灵敏度高。 2.4近红外反射光谱学（NIRS）检测法 NIRS是利用样品的光学特性，利用反射，能见度或纤维光学特性区分不同种肌肉的种类，是一种快速，有效检测不同物种肉类成分的方法。在近红外光谱范围内，利用近红外光谱学不仅能够分析分子的化学结构，而且能够构建样品特征光谱。由于近红外光谱对被检测物质无损害，且具有快速，灵敏度高，成本低等优点，已经有国外学者利用此方法分析一些碎肉的反射光谱。同时对马肉、牛肉、羊肉、驼肉等进行了鉴别，取得了良好的成效。 3讨论与展望 肉类掺假问题是一个长期存在的问题，虽然已经研究了许多相关技术进行解决但是它仍然是一个全球性的关注热点。而对于当今的科技时代，肉类掺假形式的多样化和复杂化，导致仅仅依靠传统的的感官与经验形态的方法鉴别手段，已远不能满足肉及肉制品掺假问题控制与监管的需要。科技的日新月异，将生物学、光谱学、仪器分析、化学计量学等各大学科相结合，不断发掘和研究出新的检测技术并得到了长远的发展。但是，绝大多数的检测技术所需要的大型仪器都是进口的，所花费的成本较高，而这类仪器也只有在较大规模的实验室中才有。对此，如果要提高实验室的工作效率，同时又要建立和完善从高级实验室到现场进行快速检测的实验体系，就需要不断的开发成本低，操作简便，同时灵敏度和准确度较高能用于现场快速检测的方法和检测的器材将更有助于肉制品市场的监督从而保障消费者的权益，这样的研究和开发都具有十分重要的现实意义。 参考文献 徐剑梅.欧洲马肉冒充牛肉事件席卷英法德等13国EB/OL.xx-02-13. 白羽.江苏假羊肉案嫌犯自称没用过老鼠肉EB/OL.xx-05-07. MooreJC，SpinkJ，LippM.Developmentandapplicationofadatabaseoffoodingredientfraudandeconomicallymotivatedadulterationfrom1980toxxJ.JFoodSci，xx，77（04）:R118-26. BallinNZ.Au