GB-T5009.118-2003小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA).pdf

I CS 6 7 . 0 4 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B / T 5 0 0 9 . 1 1 8 -2 0 0 3 代替 G B / T 1 4 9 3 3 -1 9 9 4小麦中T - 2毒素的酶联免疫吸附测定 （ ELI S A）De t e r mi n a t i o n o f T - 2 t o x i n i n wh e a t wi t he n z y me - l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y（ E L I S A )2 0 0 3 - 0 8 - 1 1 发布2 0 0 4 - 0 1 - 0 1实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会认 一IIJ免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / I 5 0 0 9 . 1 1 8 -2 0 0 3o li舀本标准代替 G B / T 1 4 9 3 3 - - 1 9 9 4 小麦中 r2 毒素的酶联免疫吸附测定方法（ E L I S A ) ; o本标准与 G B / T 1 4 9 3 3 -1 9 9 4 相比上要修改如下 ： 一 修改了 标准的中文名称， 标准中文名称改为 小麦中T - 2 毒素的酶联免疫吸附测定（ E L I S A) ) ;按 G B / T2 0 0 0 1 . 4 2 0 0 1 ( 标准编写规则第 4部分： 化学分析方法 对原标准的结构进行 了 修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位 ： p 生部食品 一 卫生监督检验所。本标准主要起草人： 阳传和、 罗雪云、 计融。原标准于 1 9 9 4 年首次发布， 本次为第一次修订。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 1 8 -2 0 0 3小麦中T - 2 毒素的酶联免疫吸附测定 （ ELI S A）范围本标准规定了小麦中 T - 2 毒素的酶联免疫吸附测定方法（ E L I S A ) o本标准适用于小麦及其制品中 T - 2 毒素的测定。本 方法的检出限为1 p g / k g o第一法间接法2 原理 将已知抗原吸附在固相载体表面， 洗除未吸附抗原， 加人一定量抗体 与待测试样（ 含有抗原） 提取液的混合液， 竞争温育后， 在固相载体表面形成抗原一 抗体复合物洗除多余抗体成分， 然后加人酶标记的抗球蛋自的第二抗体结合物， 与吸附在固体表面的抗原一 抗体复合物相结合。 再加人酶的底物。在酶的催化作用下， 底物发生降解反应， 产生有色产物， 通过酶标检测仪， 测出酶底物的降解量， 从而推知被测试样 中的抗原量 。3 试剂3 . 1 甲醇3 . 2 石油醚 。3 . 3 竺氯甲烷。3 . 4 无水乙醇。3 . 5 乙酸乙酉 旨 。3 . 6 二甲基甲酞胺。3 . 7四甲基联苯胺(FMB) o3 . 8 吐温 2 0 。3 . 9 3 0 过氧化氢( 3 0 Y ) H , ( .) -, )3 . 1 0 抗体： 杂交瘤细胞系 1 D 7 产生的抗 I- 2 毒素的特异性单克隆抗体。3 . 1 1 抗原： T - 2 毒素 与 载体蛋自 一 牛血清白蛋白（ B S A ） 的结合物。3 . 1 2 兔抗 鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物（ 酶标二抗） 。3 . 1 3 E L I S 八缓冲液系统。3 . 1 3 . 1 包被缓 冲液为 p H 9 . 6的碳酸盐缓 冲液， 称取 1 . 5 9 g碳酸钠（ N a _ C ( ) ) , 2 . 9 3 g碳 酸氢钠( N a l -l ( . ( ） 一 ） ， 加水稀释至 1 0 0 0 MI 。3 . 1 3 . 2 洗液为含 0 . 0叶温一 2 。 的 p H 7 . 1 的磷酸盐缓冲液（ 简称为I S S - I ) ,配制方法为： 称取 0 . 2 g 磷酸二氛钾（ K H , P ( ) , ) , 2 . ， g 磷酸氢二钠( N a _ H P O , ( 2 H , ( ) ) . 8 . 0 g 氯化钠（ N a C I ) ,。 2 g 氯化钾（ K C 1 ) , 0 . 5 r n I 、 口 土 温- 2 0 ， 力 GI 水至 1 0 0 0 n i l3 . 1 3 . 3 底物缓冲液为 p 1 1 5 . 。 的磷酸一 柠檬酸缓冲液， 配制方法为： ） co o l ; I柠檬酸（ C 1 6 H e 07 H （ ） ） ， 即称取柠檬酸 1 9 . 2 g ， 加水至 1 。 （） （） T il l ， 为甲液； 0 . 2 n io l ; I磷酸氢二钠（ V a , H P ( ) , ) , 即称取磷酸氢二钠 7 1 . 7 g ， 加水至 1 0 0 0 n i l ， 为乙液：免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 1 8 -2 0 0 3 取 甲液 2 4 . 3 ml , ， 乙液 2 5 . 7 ml - ， 加水至 1 0 0 ml , ， 即可 。3 . 1 3 . 4 底物溶液 ： 取 5 0 川公 T MB ( 1 0 m g I MB溶于 1 m l , 二甲基甲酞胺中） 溶液十1 0 m L底物缓冲液1 0 fi L3 0 过氧化氢， 混匀。3 . 1 4 I - 2 毒素标准溶液 用甲醇配成 1 m g / m l - T - 2 毒素贮备液 ， 2 0 冰箱贮存。于检测当天， 精密吸取贮备液 ， 用 2 0 /0 /0甲醇的 P B S ( 配制方法同 P B S - T ， 不加吐温- 2 0即可） 稀释成制备标准曲线的所需浓度。4 仪器 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡 ， 用 自来水、 蒸馏水冲洗。4 . 1 酶标检测仪。4 . 2 酶标板（ 4 ( ） 孔或 9 6 孔） 。4 . 3 电动振荡器。4 . 4 电热恒温水浴锅4 . 5 具 0 . 2 ml . 尾管的 1 0 MI 小浓缩瓶 。5 分 析步骤5 ， 提取 称取 2 0 g 粉碎并通过 2 0目筛的试样， 置 2 0 0 m l具塞锥形烧瓶 中， 加 8 n i l ， 水和 1 0 0 m l ， 三氯甲烷一 无水乙醇( 4 +1 ) ， 密塞， 振荡 1 1) ， 通过滤纸过滤 ， 取 2 5 m L滤液于蒸发皿中， 置 9 0 水浴上通风挥干。用 5 0 m l石油醚分次溶解蒸发皿中残渣， 洗人 2 5 0 m l , 分液漏斗中， 再用 2 0 n i l - 甲醇一 水（( 4 +1 ) 分次洗涤， 转人同一分液漏斗中， 振摇 l . 5 m i n , 静置约 1 5 m i n ， 收下层甲醇一 水提取液过层析柱净化（ 层析柱的装备 ： 在层析柱下端与小管相连结处塞约 0 . 1 g 脱脂棉 ， 尽量塞紧， 先装人 0 . 5 g中性氧化铝， 敲平表面， 再加人 0 . 4 g 活性碳， 敲紧） 。 将过柱后的洗脱液倒人蒸发皿中， 并于水浴锅上浓缩至干， 趁热加 3 m l , 乙酸乙醋 ， 加热至沸， 挥干， 再重复一次， 最后加 3 m L乙酸乙酷， 冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酷洗涤蒸发皿， 并人浓缩瓶中， 将浓缩瓶置 9 5 水浴锅上 ， 挥干冷却后 ， 用含 2 0 甲醇的 P B S 定容， 供 E L I S A检测之用。5 . 2 E L I S A检测5 . 2 . 1 用 I - 2 - B S A ( 4 ji g / ml- ） 包被酶标板， 撼孔 1 0 0爪 一 ， 4 过夜；5 . 2 . 2 酶标板用 P B S - 1 , 洗 3 次， 每次 3 m i n 后， 加人不同浓度的 F - 2 标准溶液（ 制作标准曲线） 或试样提取液（ 检测试样中的毒素含量） 与抗体溶液的混合液（( 1 +1 ， 每孔 1 0 0 1 1 - ， 该混合液应于使用的前一天配好， 4 过夜备用） ， 置 3 7 0C 1 h ;5 . 2 . 3 酶标板洗 3 次， 侮次 3 m i n 后 ， 加人酶标二抗 ， 每孔 1 0 0 u L , 3 7 0C l . 5 h ;5 . 2 . 4 I司I 几 述洗涤后， 加人底物溶液， 每孔 1 0 0 tt 1 _ , 3 7 0C 3 0 m i n ;5 . 2 . 5 用 ！ moll/1硫酸溶液终止反应， 每孔 5 0川 ， 于 4 5 0 n m处测定吸光度值。6 结 果计算按 式（( 1 ） 计算 ：X 一 一 X V , 、 ，。 X 生 VI 刀 。 。 （1）式 中：X 一 一I - 2 浓度， 单位为纳克每克（ n g / g ) ; 一 酶标板 1几 所测得的 一 l- 2 毒素的量( n g ) ， 根据标准曲线求得；V 一 一试样提取液的体积， 单位为毫升（ r n l .) ;免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 1 8 -2 0 0 3V 2 滴加样液的体积， 单位为毫升（ ML ) ;D 一一样液的总稀释倍数；m 试样质量， 单位为克（ 9 ） 。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 2 0 %.第二法直接法8 原理 将已知抗原吸附在固相载体表面， 洗除未吸附的抗原 ， 加人一定量的酶标记抗体与试样（ 含有抗原）提取液的混合液 ， 竞争温育后 ， 在固相载体表面形成抗原一 抗体一 酶复合物。洗除多余部分， 加入酶的底物。在酶的催化作用下， 底物发生降解反应 ， 产生有色物质， 通过酶标检测仪， 测出酶底物的降解量 ， 从而推知被测试样中的抗原量。9 试剂9 . 1 甲醇。9 . 2 石油醚。9 . 3 三氯甲烷。9 . 4 无水乙醇。9 . 5 乙酸乙酉 旨 。9 . 6 二甲基甲酸胺。9 . 7 四甲基联苯胺（ T MB ) a9 . 8 吐温一 2 0 09 . 9 3 0 过氧化氢( 3 0 %H 2 0 2 ) 。9 . 1 0 抗 T -2 毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。9 . 1 1 抗原： T - 2 毒素与载体蛋白一 牛血清白蛋白的结合物（ T - 2 - B S A ) o9 . 1 2 E L I S A缓冲液系统。9 . 1 2 . 1 包被缓 冲液为 p H9 . 6的碳 酸盐缓 冲液， 称取 l . 5 9 g碳酸钠 （ N a y C 0 3 ) , 2 . 9 3 g碳酸氢钠( N a H C 0 3 ) ， 加水稀释至 1 0 0 0 m l -9 . 1 2 . 2 洗液为含。 . 0 5 吐温一 2 0 的p H7 . 4 的磷酸盐缓冲液（ 简称为P B S - T ) ， 配制方法为： 称取0 . 2 g 磷酸二氢钾（ K H 2 P 0 , ) , 2 . 9 g 磷酸氢二钠（ N a t H P O , 1 2 H 2 0) , 8 . 0 g 氯化钠（ N a C I ) ,0 . 2 g 氯化钾（ K C I , 0 . 5 m l ， 吐温- 2 0 ， 加水至 1 0 0 0 m l -9 . 1 2 . 3 底物缓冲液为 p H5 . 0 的磷酸一 柠檬酸缓冲液， 配制方法为 ： 0 . 1 m o l / I、 柠檬酸（ C , H 8 0 , H , 0 ) ， 即称取1 9 . 2 g 柠檬酸， 加水至1 0 0 0 m L ， 为甲液； 0 . 2 m o l / L磷酸氢二钠（ N a t H P O , ) ， 即称取 7 1 . 7 g 磷酸氢二钠 ， 加水至 1 0 0 0 mL ， 为乙液； 取甲液 2 4 . 3 m l - ， 乙液 2 5 . 7 m L ， 加水至 1 0 0 m L ， 即可。9 . 1 2 . 4 底物溶液 ： 取 5 0 f.c l . T MB ( 1 0 m g T MB溶于 l ml . 二 甲基甲酞胺中） 溶液1 0 mL底物缓冲液十1 0 I d _ 3 0 过氧化氢， 混匀。9 . 1 3 T - 2 毒素标准溶液 用甲醇配制 1 m g / n i l , T - 2 毒素贮备液， - - 2 0 冰箱贮存 。于检测 当天， 精密吸取贮备液 ， 用 2 0 %甲醇的 P B S ( 配制方法 同 P B S - T， 不加吐温- 2 0即可） 稀释成制备标准曲线的所需浓度。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB / T 5 0 0 9 . 1 1 8 -2 0 0 31 0 仪器 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡， 用白来水、 蒸馏水冲洗。1 0 . 1 酶标检测仪。1 0 . 2 酶标板 （ 4 0 孔 或 9 6孔 ） 。1 0 . 3 电动振摇器。1 0 . 4 电热恒温水浴锅（1 0 . 5 具 0 . 2 n i l尾管 的 1 0 ml小浓缩瓶 。1 1 分析步骤1 1 . 1 提取 称取 2 0 g 粉碎并通过 2 0目筛的试样， 置 2 0 0 n i l 具寒锥形烧瓶 中， 加 8 m l水和 1 0 0 m l三氯甲烷一 无水乙醇( 4 - 1- 1 ) ， 密塞， 振荡 1 1 1 ， 通过滤纸过滤 ， 取 2 5 ml滤液于蒸发皿中， 置 9 0 0C水浴上通风挥干。用 5 0 m 1石油醚分次溶解蒸发R中残渣 ， 洗人 2 5 0 m l 分液漏斗中， 再用 2 0 m L甲醇一 水（( 4 +1 ) 分次洗涤， 转人同 一 分液漏 斗II I , 振摇 1 . 5 m i n , 静置约 1 5 m i n ， 收下层甲醇一 水提取液过层析柱净化（ 层析柱的装备： 在层析柱下端与小管相连结处塞约 0 . 1 g 脱脂棉 ， 尽量塞紧， 先装人 0 . 5 g中性氧化铝， 敲平表面， 再加人 0 . 49 活性碳， 敲紧） 。 将过柱后的洗脱液倒人蒸发皿中， 并于水浴锅上浓缩至干， 趁热加 3 n i l乙酸乙醋， 加热至沸， 挥干， 再重复一次， 最后加 3 m 1 . 乙酸乙醋， 冷至室温后转人浓缩瓶中。用适量乙酸乙醋洗涤蒸发皿， 并人浓缩瓶中。将浓缩瓶置 9 5 水浴锅 F -. ， 挥 l 冷却后 ， 用含 2 0 甲醇的 P B S 定容， 供 E I A S A检测之用。1 1 2 E L S A检测1 1 . 2 . 1 用 T - 2 - B S A( 4 ji g / ml , ） 包被酶标板， 每孔 1 0 0 IA I .