各期梅毒试验诊断方法.ppt

各期梅毒实验诊断方法,广东省皮肤病医院 广东省皮肤性病防治中心 郑和平 PhD,“广东疮”,广东与全国梅毒比较 1995-2011(incidence/100,000),1995-2011年 广东省各期梅毒发病情况,GD STD LG Yang,2011年，全省21个地市报告梅毒51,051例，报告数占全国报告总数的11.88%，位居全国第一,梅毒诊断的准确性如何？,某省疾控中心共核查后天梅毒164例，其中，未做RPR定性的43例，未进行RPR定量的64例，根据临床表现但无症状记录的92例。核实7例先天梅毒均不符合国家确诊标准。 诊断技术的掌握和正确应用很重要,先天梅毒血清学的随访研究 5年上海市99例报道先天梅毒患儿 TPPA随访 转阴率 累计阴转率 1个月 1.14 1.14 3个月 17.65 18.59 6个月 39.91% 44.57% 12个月 40 66.74 18-24月 23.08 74.42 1顾伟鸣等，先天梅毒的血清学随访，中华传染病杂志 2007，25（2）：117-119 误诊率？ 检测能力差！,梅毒诊断的准确性如何？,2011年梅毒诊断试剂临床评估结果,中国性病控制中心，广西皮肤病防治研究所、北京市CDC、云南省CDC、甘肃省CDC、浙江省皮肤病防治研究所等,中国预防与控制梅毒规划 （2010-2020年）,加强梅毒检测质量控制和实验室能力建设，充分利用现有资源，开展梅毒检测实验室质量考评和技术指导，提高梅毒实验室检测的准确性和梅毒确证检测的可及性”,各期梅毒实验诊断方法,未经治疗的梅毒病人的自然病程,感染梅毒螺旋体,一期梅毒,二期梅毒,潜伏梅毒,三期梅毒,72%,30%,终生潜伏梅毒,中枢神经系统感染,28%,感染梅毒螺旋体,2-6周,1-3月,1-3月,2-50年,2Gjestland, T. 1955. The Oslo study of untreated syphilis; an epidemiologic investigation of the natural course of the syphilitic infection based upon a re-study of the Boeck-Bruusgaard material. Acta Derm. Venereol. 35:3368; Annex I-LVI.,一期梅毒的临床表现与实验室诊断,入 侵 部 位,临床表现,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,致病性螺旋体,一，梅毒病原学检测,1，病原学检测： 1）暗示野镜检： 方法：渗出液混于盐水中，暗示野镜观察 结果：可见典型梅毒螺旋体和特殊运动方式,5R. Heymans, et al. J. CLIN. MICROBIOL.2010 48(2):497,2）暗示野与PCR检测. 5 Clinical Value of Treponema pallidum Real-Time PCR for Diagnosis of Syphilis,6Molecular Characterization of Syphilis in Patients in Canada: Detection of Treponema pallidum DNA in Whole-Blood Samples versus Ulcerative Swabs J. CLIN. MICROBIOL. 2009,47（6）：1668,病人87例:41梅毒（19例一期,9例二期,10例潜伏,3例先天） 靶基因：T. pallidum tpp47, bmp, polA，23S rRNA gene 结果： 结论：溃疡拭子样本适合于一期梅毒的PCR检测 二期血液样本中50%活动性梅毒可检测到TP-DNA,WHO推荐暗示野镜检诊断早期梅毒，早于抗体出现前数日至数周 organisms/mL required for visualization 敏感性80%，但阴性不能排除梅毒 3Larsen S, et al. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev 1995;8:121. 假阳性:与口腔肛周其他螺旋体相似，不推荐口腔肛周标本 4Tramont E. Syphilis in adults: from Christopher Columbus to Sir Alexander Fleming to AIDS. Clin Infect Dis 1995;21:136171 PCR敏感性特异性高.适宜早期诊断。,病原体检测,二、血清学检查 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 VDRL、USR、RPR、TRUST 2. 梅毒螺旋体抗原血清学试验 FTA-ABS、TPHA、 TPPA、ELISA、TP-RT IgM,非梅毒螺旋体抗原血清学试验： 原理：梅毒螺旋体破坏宿主细胞释放以及其螺旋体细胞表面释放的类脂物质，刺激机体产生抗类脂抗体（反应素）。在体外该抗体与心磷脂、卵磷脂和胆固醇组成的抗原反应，形成凝集反应。 方法：VDRL (venereal disease research laboratory test) USR (unheated serum reagin test) RPR (rapid plasma reagin circle card test) TRUST (tolulized red unheated serum test) 特点：非特异性反应,2、梅毒螺旋体抗原血清试验,原理：基于TP特异性抗原，检测TP抗体 方法： 凝集法：TPHA， TPPA FTAABS ELISA 19sIgM TP-RT（胶体金法）,19S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,1）TPPA/TPHA 原理： 超声裂解TP抗原或基因工程抗原，致敏明胶颗粒/家禽RBC，与血清中抗TP抗体结合，发生凝集反应。 临床：梅毒确证 注意 存在交叉（1：80） 低滴定时候，FTA-ABS确证,2）FTA-ABS(fluoresent treponemal antibody absorption test) 原理：血清经吸收剂（Reiter)去非特异性抗体，与TP反应，形成Ab+Ag复合物；再加TITC标记的抗人IgG/IgM抗体，形成荧光复合物，荧光镜下，TP呈苹果绿色荧光。 临床：最可靠确证试验 特点：高度特异，,3）ELISA： 原理：TP特异性抗原包备酶标板，与血清中TP抗体结合，加入酶标抗体，底物显色。 临床：用于梅毒筛查。 注意： 高敏感性，特异较差。,4) 19sIgM: 原理：ELISA， WB等 临床：早期梅毒诊断 先天梅毒诊断,5）TP-RT胶体金法： 原理（见图） 临床：筛查 注意： 高敏感性，特异较差。,11Reactivity of Microhemagglutination, Fluorescent Treponemal Antibody bsorption, and Venereal Disease Research Laboratory Tests in Primary Syphilis,11 JOHN D. DYCKMAN, J. CLIN. MICROBIOL. 1980,12（4）：629,VDRL、FTA-ABS、TPHA关系,12S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,梅毒螺旋体血清学检测用试剂的 敏感性和特异性 2011年国家公布,一期梅毒血清学 非梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性(1:8) 梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性（1:320) 单次阳性结果应结合临床病史慎重诊断，阴性并不能排除梅毒，需连续观察抗体滴度。 IgM抗体早于IgG抗体，常为阳性反应 18Baughn, R. E., and R. F. Schell. 2001. Immune responses to Treponema pallidum and Borrelia burgdorefi, p. 27.127.7. In R. R. Rich (ed.), Principles and practice of clinical immunology, 2nd ed. Mosby, St. Louis, Mo.,二，梅毒血清学筛查策略：,梅毒筛查策略 I RPR/TRUST阳性 TPPA/FTA阳性 梅毒 特点：传统方法，漏检高（15%），现症。,梅毒筛查策略 II：,TP-ELISA阳性 TPPA阳性确证（阳性） TRUST阳性 梅毒 特点：批量检测，敏感性高 ，需现症鉴别,梅毒筛查策略 III：,TP-RT阳性 TPPA阳性确证（阳性） TRUST阳性 梅毒 特点：简便快速，敏感性高 ，需现症鉴别,互为确证试验,RPR阳性 TPPA阳性 梅毒 TPPA阳性 RPR阳性 梅毒 梅毒确诊,一期梅毒血清学 非梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性(1:8) 梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性（1:320) 单次阳性结果应结合临床病史慎重诊断，阴性并不能排除梅毒，需连续观察抗体滴度。 IgM抗体早于IgG抗体，常为阳性反应 18Baughn, R. E., and R. F. Schell. 2001. Immune responses to Treponema pallidum and Borrelia burgdorefi, p. 27.127.7. In R. R. Rich (ed.), Principles and practice of clinical immunology, 2nd ed. Mosby, St. Louis, Mo.,二期梅毒的临床表现与实验室诊断,临床表现,12S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,非梅毒螺旋体抗体100%阳性，且滴度1:32 梅毒螺旋体抗体100%敏感性与98%特异性，且滴度640, 大量抗体的产生可能导致前带现象。 皮损暗视野检测绝大多数可检测到螺旋体，但由于血清学方法的简单性，而检测较少。 20Robert E. Baughn and Daniel M. Musher. Secondary Syphilitic Lesions CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 2005, 205216,二期梅毒,三期梅毒的临床表现与实验室诊断,临床表现,晚期,12S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,三期梅毒实验室诊断,晚期梅毒的皮损中，极难找到TP。 非梅毒螺旋体抗体71%阳性，梅毒螺旋体抗体96%阳性。 脑脊液WBC、蛋白、VDRL阳性。,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,未治疗早期梅毒孕妇的胎儿感染率75-95,四、先天梅毒的临床表现 与实验室诊断,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,孕妇梅毒的后果,约837周早产 约11低体重儿 约5为产期死亡 约4胎儿死亡 约1.5%新生儿死亡 约2先天畸形,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,先天梅毒分期,早期先天性梅毒：2岁以内 晚期先天性梅毒：2岁以上,临床表现,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,孕妇梅毒的筛查 -预防和发现先天梅毒的关键,孕妇梅毒筛查：妊娠期或分娩时至少做一次梅毒血清学试验。,28% of positive RPR in pregnant women are biological false positives. 21Tosanna W. Peeling and Htun Ye. Diagnostic tools for preventing and managing maternal and congenital syphilis: an overview. Bulletin of the WHO 2004 82(6):438,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,先天梅毒实验室诊断,WHO和美国CDC推荐应符合四项之一： 在新生儿体内查到梅毒螺旋体； 抗心磷脂抗体滴度持续上升； 出生时患儿抗心磷脂抗体滴度高于其母亲4倍 检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性。 22Saloojee H, et al. The prevention and management of congenital syphilis: an overview and recommendations. Bull World Health Organ, 2004, 82:424-430. 23Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Congenital syphilis-United States, 2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2004，53：716-719.,1. 病原体检测： 1）暗示野检查： Darkfield examinations of amniotic fluid obtained by amniocentesis have been shown to be of value in the diagnosis of congenital syphilis 5例发生死胎的未治疗梅毒孕妇 羊水暗示野检查100%可见螺旋体 活检组织中2/5镀银染色阳性。 24Wendel G, Maberry M, Christmas J, et al. Examination of amniotic fluid in diagnosing congenital syphilis with fetal death. Obstet Gynecol 1989;74:96770.,2）PCR检测TP,25Use of Polymerase Chain Reaction and Rabbit Infectivity Testing To Detect Treponema pallidum in Amniotic Fluid, Fetal and Neonatal Sera, and Cerebrospinal Fluid GRIMPREL E, et al J. CLIN. MICROBIOL.1991, 29:1711,然而： 许多先天梅毒患儿出生时通常无临床症状。 15月的新生儿由于母亲抗体的被动转移而至IgG检测无法鉴别先天梅毒。 通常新生儿RPR滴度大于母亲4倍时强烈支持先天梅毒。但研究发现30%先天梅毒患儿RPR滴度如此。 26Rawstron SA,et al. congenital syphilis and fluorescent treponemal antibody test reactivity after the age of 1 year. Sexually Transmitted Diseases 2001; 28:412,3）血清TP-IgM检测,28 Evaluation of Immunoglobulin M Western Blot Analysis in the Diagnosis of Congenital Syphilis,results indicate that this technique can be used to identify both symptomatic （92%）and asymptomatic （92%） infection in infants with T. pallidum。特异性100%。,LEWIS LL， J. CLIN. MICROBIOL. 1990，28:296,IgM检测,在诊断先天梅毒时有重要的意义， 但早期的治疗可使新生儿IgM消退， 故IgM阴性不能排除先天梅毒。 国家标准：最新加入随访18个月TPPA阳性者为先天梅毒。 先天梅毒实验室诊断需要结合临床综合分析,五、神经梅毒,早期梅毒常常累及中枢神经系统，CSF异常改变通常是短暂的，但一些未治疗的患者可持续性异常。 31 Hunter, EF, et al. 1982. Sodium desoxycholate extracted treponemal antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay for syphilis. J. Clin. Microbiol. 16:483-486 晚期神经梅毒占梅毒患者10%，多在感染后3-20年发病。晚期神经梅毒代表着早期梅毒侵犯的继续。 引起脑（脊）膜血管，神经实质（神经细胞及其突起和神经胶质等损害。,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,神经梅毒实验室诊断： 脑脊液常规检查： 脑脊液VDRL试验： 鞘内IgM、IgG测定： 脑脊液中梅毒螺旋体检测 脑脊液特异性IgM测定：,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,1、脑脊液检查： WBC5个/mm3，总蛋白400mg/L.表明CSF炎症 可能为活动性神经梅毒，判断疗效:WBC降低 2、脑脊液VDRL试验: CSF标准血清学试验。 特异性强，敏感性较低。 阳性时考虑神经梅毒，但有假阴性。 sensitivity was 50%？ and specificity 90.6% using positive CSF-VDRL as the gold standard for neurosyphilis. Sensitivity was 61.5% and specificity was 83.6% using both the CSF-VDRL and CSF-WBC criteria,32Cerebrospinal fluid treponemal antibodies in untreated early syphilis,1. 39 cases，其中15 HIV 阳性. 2. 测定：CSF-WBC,蛋白, VDRL，TPHA，FTA-ABS，白蛋白比例，IgG index. 3.结果： 4. 结论：VDRL CSF treponemal tests may help to exclude a diagnosis of neurosyphilis in patients with early syphilis.,Marra CM, et al. Arch Neurol. 1995 Jan;52(1):68-72.,33Clinical significance of cerebrospinal fluid tests for neurosyphilis.,1665例CSF，1978-1987年间. FTA-ABS检测48例阳性,其中15例诊断神经梅毒。 VDRL检测4例阳性，VDRL特异性100%，但敏感性27%。 FTA-ABS敏感性高，但特异性差无法区别活动性神经梅毒与以往梅毒。,Davis LE, et al. Ann Neurol, 1989,25:50,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,3，鞘内IgG测定：鉴别鞘内生成或源自血清？ 活动性神经梅毒时，CSF的梅毒IgG抗体增高 1，白蛋白系数CSF白蛋白/血清白蛋白。 判断血脑屏障功能，正常为0.008-0.0074 2，IgG指数 CSF总IgG x血清白蛋白 血清总IgG x CSF白蛋白 0.7时表示鞘内生成IgG。,广东省皮肤性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,4，鞘内TP特异性IgG生成判断； 1）TPHA指数CSFTPHA滴度/白蛋白系数X103 500表明鞘内生成TP特异性IgG和活动性神经梅毒 2）改良TPHA指数CSFTPHA滴度/血清TPHA滴度 白蛋白系数 2神经梅毒。 3）鞘内TP抗体 CSFTPHA滴度X血清IgG 血清TPHA滴度XCSF总IgG 0.5-2为正常；2活动性神经梅毒。