圣湘生物PCR新技术简介迪安培训.ppt

,高精度PCR检测肝病毒的现状及进展 湖南圣湘生物科技有限公司 唐国政,HBV慢性携带者（3.5亿慢性携带者）（分布）百分率, 2% 低分布区,2-7% 中度分布区, 8% 高度分布区,乙肝病毒感染呈全球性分布,中国是乙肝“大国”,乙肝是我国一个威胁健康的严重问题,每年有35万人死于乙肝病毒引起的肝脏疾病 其中18万人死于乙肝病毒引起的肝癌,1.2亿乙肝病毒携带者,3000万慢性乙肝患者,“十一五”重大传染病专项计划病毒性肝炎重大研究专项启动,2009年，我国病毒性肝炎领域最重要的进展是国家“十一五”重大传染病专项计划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项启动（见表1）。 这是“十一五”期间与“载人航天与探月工程、大型飞机”等相平行的16个重大专项计划之一。,表1 、国家中长期科技发展规划纲要（20062020年）确定的重大科技专项,HBV 复制周期(Replication cycle of HBV),慢性乙肝的本质是由病毒引发的 免疫清除给肝细胞带来的损伤,免疫系统,主 题,肝病毒PCR检测的临床需求及现状 高精度肝病毒PCR检测技术介绍,血清HBV DNA水平是临床上评价HBV复制情况的“金标准”,Lok AS, et al. Hepatology. 2009;50:661-662 Liaw YF, Liver International, 2009,29(s1):100-1-7,慢性乙肝病毒感染的自然史,急性HBV 感染,慢性携带者,康复,3050 年,慢性 乙肝,稳定,进展,肝硬化,代偿性肝硬化,肝癌,死亡,失代偿肝硬化(死亡）,HBV DNA高载量是肝硬化发生的重要相关因素, N=3,774; p value for log-rank test, 0.001,Chen CJ et al JAMA 2006;295:65 Iloeje U et al Gastroenterology 2006,130:678-686,全球权威指南一致认为：乙肝治疗的根本目的在于长期持续抑制病毒复制，阻止疾病进展,“持续抑制病毒复制，减轻肝脏炎症、坏死，从而延缓和阻断肝硬化和肝癌的发生”,抗病毒治疗为什么需要长期？,病毒很难除“根”cccDNA,抗病毒治疗只是抑制病毒复制,停药后，病毒“复活”，导致疾病反复、进展,需要长期抗病毒治疗,长期抗病毒治疗带来的益处,抑制乙肝病毒复制，延缓疾病进展,提高生活质量，延长存活时间,调节乙肝患者的精神状态，减轻心理压力,减轻家庭经济负担和家庭成员的负担,目前常用的抗病毒药物:,干扰素 普通干扰素 聚乙二醇干扰素-2a(PEG-IFN-2a) 核苷(酸)类似物 拉米夫定 阿德福韦酯 恩替卡韦 替比夫定等,干扰素治疗有哪些优点和缺点？,干扰素是通过调节机体免疫力达到治疗目的 优点： 疗程固定 缺点： 为注射制剂，使用不方便 降病毒能力不强 副作用较大 禁忌症较多 耐受率低,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50 (2009) 227242,核苷类药物治疗有哪些优点和缺点？,核苷类药物直接抑制病毒复制 优点： 降病毒快速、强效 为口服制剂，使用方便 不良反应少 缺点： 有耐药性 疗程不确定,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50 (2009) 227242,现有的抗病毒药物,-干扰素 拉米夫定 阿德福韦酯、聚乙二醇干扰素等,80年代,90年代后期,2005年后,反应乙肝病毒载量金标准：乙肝病毒DNA检测,HBV DNA：乙肝病毒脱氧核糖核酸，可直接了解 体内病毒载量和复制情况；并可用于判断抗病毒治 疗的效果。,2012： HBV DNA detection and HBV DNA level measurement are essential for the diagnosis, decision to treat and subsequent monitoring of patients (A1). Follow-up using realtime PCR quantification assays is strongly recommended because of their sensitivity, specificity, accuracy and broad dynamic range 3841 (A1).,2009： Recently, HBV DNA assays that utilize real-time PCR technology with improved sensitivity(5-10 IU/mL) and wider dynamic range (up to 8-9 log10 IU/mL) have become available,乙肝治疗指南：美国和欧洲,Hepatology, 2009 J Hepatol, 2012,HBV DNA载量PCR检测的国际指南,谁需要检测： HBsAg阳性患者和HBsAg阴性的高危人群 携带者、慢乙肝患者、肝硬化和肝癌患者 什么时候检测： 未治疗患者、治疗前、治疗中、结束治疗后均需检测,HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,抗病毒治疗前病毒基线的准确测定： 适宜抗病毒治疗患者选择、抗病毒治疗方案的确定、抗病毒疗效的预测与后续疗效比对 抗病毒治疗过程中疗效的评估和方案优化、耐药突变检测和治疗终点的确认 抗病毒优化治疗停药后随访及复发再治的判断 隐匿性病毒性肝炎的诊断,高精度核酸定量检测是保证乙肝患者 走好抗病毒优化治疗之路的导航系统,HBV DNA定量PCR检测的国际指南要求,超敏感（Hypersensitivity） HBV最低检测限10-15 IU/ml 宽线性范围（ wider dynamic range ） 涵盖101109 IU/ml 高特异性（ High specificity） 可重复性好（ Repeatability） （操作简单，或可自动化）,HBV DNA 检测临床应用发展,进口HBV DNA PCR试剂性能的比较,我国某些RT-PCR乙肝试剂盒的灵敏度及线性范围现状：,国产HBV DNA PCR试剂性能现状,现有的国产试剂在检测灵敏度、线性范围、可重复性等方面无法满足临床上日益增加的对HBV DNA定量准确性和灵敏度的要求 部分试剂缺乏内标，影响定量准确性,中华检验医学杂志，2012,(无天、无地、无标、无法),HBV DNA定量使用低精度试剂的后果,临床实践中影响临床疗效的准确评估，从而使病人疗效出现偏差 临床研究中弱化抗病毒疗效,主 题,肝病毒PCR检测的临床需求及现状 超敏感肝病毒PCR检测技术介绍,磁珠法 在样本中加入超顺纳米磁珠，富集微量的病毒核酸分子，然后再扩增,动画演示,乙肝病毒核酸提取不同技术比较,磁珠法的性能之一,灵敏度达到 10 IU/ML 低浓度样本（10 IU/ml）的灵敏度检测结果图（重复90次，检出率为100%）,线性范围宽： 20 IU/ml2.00E+09 IU/ml,磁珠法的性能之二,重复性好，精密度高 批内(重复10次测试) 、批间(重复30次测试)Ct值变异系数（CV）均2%；浓度值对数值变异系数（CV） 8%,磁珠法的性能之三,抗干扰能力强，在高血脂、溶血、黄疸及药物治疗后等异常样本时，提高了检测的可靠性,磁珠法的性能之四,操作简单，过程温和，提取快速。与其它方法相比，无需加热、无需高速离心、无需分离上清液或磁珠颗粒,磁珠法的性能之五,圣湘高精度HBV DNA试剂性能多中心评测,研究单位 负责人 中南大学湘雅医院 谭德明 中国医科大学盛京医院 窦晓光 南方医科大学南方医院 陈金军,初步报告，2012,研究方法,502份慢性乙型肝炎患者的血浆或血清样本(来自于三所医院的门诊和住院病人)，采集的标本-20-80低温冰箱保存，同时用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan（CAP/CTM）HBV诊断试剂和湖南圣湘生物科技有限公司的磁珠法HBV DNA定量试剂进行检测。,圣湘磁珠法HBV DNA试剂与罗氏试剂比较 研究结果,圣湘磁珠法HBV DNA试剂与罗氏试剂比较 研究结果,罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测结果比较统计表 罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测结果的一致性分析： 阳性一致性百分比=468/472100%99.2% 阴性一致性百分比= 94/153100%61.4% 总一致性百分比=（468+94）/635100%88.5%,磁珠法HBV DNA检测试剂与罗氏试剂比较 研究结果,罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测均有定量结果的样本共407例 两种试剂定量差异: 罗氏：7份； 罗氏圣湘：14份,两种试剂定量检测结果的散点图,两种试剂检测结果的拟合优度情况（相关分析）,（回归分析）常数项和系数的检验结果,对检测均为阳性的样本，圣湘磁珠法试剂与罗氏试剂的定量检测结果具有线性相关，相关系数R=0.966；回归方程为：y=0.134+1.005x。,磁珠法HBV DNA检测试剂与罗氏试剂比较 研究结果,圣湘磁珠法与其它磁珠法病毒核酸提取差异,圣湘生物磁珠法肝病毒试剂盒的性能,国内市场,北京佑安医院 北京首钢医院 郑州大学第一附属医院 河南科技大学第一附属医院 河南省传染病医院 石家庄传染病医院 蚌埠医学院附属医院 长征医院 上海长海医院 陕西省人民医院 山西省人民医院,佑安医院,郑大一附院,陕西省人民医院,国内市场,武汉协和医院 湘雅一、二、三附属医院 广东省第二人民医院 湖南省人民医院 湖南省肿瘤医院 郴州市第一人民医院 福建医科大学第一附属医院 重庆大坪医院 超过300家三级医院,湘雅医院,武汉协和医院,广州金域医学检验中心,社会价值,2012年6月25日，人民日报头版头条新闻：从“杂交水稻之父”袁隆平到以“高性能炭/炭复合材料”拿下空缺6年的国家技术发明一等奖的黄伯云，以及荣获美国“国家科技奖章”、拥有16项自主创新专利的戴立忠，一批科技领军人物在湖南涌现，一批后起之秀在湖南集聚。,核心技术领军人物-戴立忠 博士,2010年，中组部部长李源潮关心公司发展,改变，从现在开始,解读基因，扩增健康,标本类型,血清（2-3ML） 最好是使用EDTA抗凝全血标本，抗凝后6h内分离血浆。如使用血清标本，则需