课件：基因治疗技术与应用.ppt

基因治疗技术与应用,授课人：授课时间：2015.1.9,内容,基因治疗,基因治疗的应用,基因缺陷病,1.基因缺陷病,基因是具有遗传效应的DNA分子片段。位于染色体上，呈线性排列。基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表达。人类只有一个基因组，大约有510万个基因。当正常单个基因的DNA碱基对排列出现异常时，如碱基对置换、增添或缺失而引起基因结构变化，称作点突变。功能基因也可能部分片段或整个丢失，从而导致基因病。 基因病主要分为单基因病和多基因病两大类。,1.1 单基因病,如果一种遗传病的发病仅涉及一对基因，它所导致的疾病就是单基因病。 包括以下几类： 常染色体显性遗传病 常染色体隐性遗传病 X连锁显性遗传病 X连锁隐性遗传病 Y连锁遗传病,1.1.1 常染色体显性遗传病,常染色体显性遗传病只要有一个致病基因便会表现症状,患者的子代有50%也是患者，而且世代相传。,多指,并指,原发性青光眼,1.1.2 常染色体隐性遗传病,常染色体隐性遗传病要有两个等位致病基因才会发病，患儿的父母往往都是致病基因携带者，凡是代谢性遗传病均属于常染色体隐性遗传病。,苯丙酮尿症,1.1.3 X连锁显性遗传病,X连锁显性遗传病的致病基因位于X染色体上，男性只有一条X染色体，表现症状较重，女性有两条X染色体表现症状较轻，但女性受累者是男性的两倍。,抗维生素D佝偻病,1.1.4 X连锁隐性遗传病,X连锁隐性遗传病传男不传女，往往母亲是携带者儿子为患者。,血友病A,1.1.5 Y连锁遗传病,Y连锁遗传病的特点是父亲传递给儿子，女儿不发病。因Y染色体上主要有男性决定因子方面的基因，其他基因很少，故Y连锁遗传病极少见。,毛耳性状,1.2 单基因遗传病,血红蛋白病 血浆蛋白病 结构蛋白缺陷病 受体蛋白病 膜转运蛋白病,1.2.1 血红蛋白病镰状细胞贫血症,1.2.2 血浆蛋白病血友病,血友病A（血友病甲），即因子促凝成分（：C）缺乏症，也称AGH缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。 血友病B（血友病乙），即因子缺乏症，又称PTC缺乏症、凝血活酶成分缺乏症，亦为性联隐性遗传，其发病数量较血友病A少。但本型中有出血症状的女性传递者比血友病A多见。 血友病C（血友病丙），即因子（F）缺乏症，又称PTA缺乏症、凝血活酶前质缺乏症。为常染色体不完全隐性遗传，男女均可患病，是一种罕见的血友病。 1520/10万男孩中有发病，此发病率在所调查的不同的种族和地域之间没有差异。发病率以血友病A最多占85%，血友病B占15%，血友病C较少见。,1.2.3结构蛋白缺陷病Ehlers-Danlos综合症,COL5A1基因的22号内含子发生剪切突变,1.2.4 受体蛋白病家族性高胆固醇血症,家族性高胆固醇血症是低密度脂蛋白（）受体基因突变所致的常染色体显性遗传性疾病，目前已发现的受体基因突变达多个。,黄色瘤,角膜弓,1.2.5 膜转运蛋白病先天性半乳糖吸收不良症,小肠上皮细胞转运葡萄糖、半乳糖的膜载体蛋白异常，致使葡萄糖和半乳糖吸收障碍，患者肠道内渗透压改变而使肠液增加，患者出现水样腹泻。,1.3 多基因病,如果一种遗传病的发病涉及多个基因，由多个微效的基因累加作用共同影响下造成的疾病称作多基因病。多基因遗传病发病也受环境因素的影响，患者同胞的发病率大约仅1%10%。 常见的多基因遗传病有消化性溃疡、原发性高血压、先天性心脏病、哮喘、精神分裂症、无脑儿、糖尿病等，以及先天畸形（唇腭裂、脊柱裂、无脑儿等）。,1.3.1 先天性心脏病,心室间隔缺损（VSD）,心房间隔缺损（ASD）,法洛四联症,1.3.2 基因缺陷病,先天性幽门狭窄,先天性髋脱臼,先天性巨结肠症,1.4 治疗方法,传统治疗方法 药物治疗 手术治疗 放射治疗 理疗 新的生物治疗： 基因治疗 (gene therapy),基因缺陷病 的产前诊断,内容,基因治疗,基因治疗的应用,基因缺陷病,2 基因治疗,基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。 狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，而广义的基因治疗还包括利用基因药物或核酸药物的治疗。,2.1 基因治疗的策略,直接策略 针对致病基因 间接策略 导入与致病基因无直接联系的治疗基因,2.1.1 直接策略,针对致病基因 基因修正（gene correction） 基因替代（gene replacement） 基因增强（gene augmentation） 基因干预（gene interference）,2.1.1.1 基因修正,基因修正（gene correction） 指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。,2.1.1.2 基因替代,基因替代（gene replacement） 指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替换致病基因。（不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。）,基因打靶,2.1.1.3 基因增强,基因增强（gene augmentation） 又称基因修饰，是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。 目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。,基因增强奥运,2.1.1.4 基因干预,基因干预（gene interference） 是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。 导入抑癌基因 反义核酸技术 (antisense technology)： 反义RNA；反基因技术；核酶 RNA干扰（RNA interference),2.1.1.4.1 抑癌基因疗法,抑癌基因： 是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤生的一类基因群。 Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因,2.1.1.4.2 反义核酸技术,反义RNA（antisense RNA） 与mRNA互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。 核酶（ribozyme） 具有催化功能的RNA，其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。 反义脱氧寡核苷酸，ODN,核酶,2.1.1.4.3 RNA干扰,概念：短的双链RNA (dsRNA) 导入细胞，可以使同源mRNA发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。 特点 高度的序列专一性 高效性 易操作性,2.1.2 间接策略,导入与致病基因无直接联系的治疗基因 免疫基因治疗 分子化疗 特异性细胞杀伤,2.1.2.1 免疫基因治疗,将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。 细胞因子基因治疗 IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、 INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF 免疫增强基因疗法 MHC I类抗原、共刺激分子 肿瘤DNA疫苗疗法 癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗,2.1.2.2 分子化疗,自杀基因疗法： TK基因、CD基因 化疗保护性基因治疗： MDR基因 药物增敏基因治疗： 钙调素基因,自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒 Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,2.1.2.2.1 自杀基因疗法,自杀基因（suicide gene)，前体药物酶转化基因。,自杀基因,2.1.2.2.2 化疗保护性基因治疗,指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。 如将多药抗性（multiple drug resistance, MDR）基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。,2.1.2.2.3 药物增敏基因治疗,将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。 如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。,2.1.2.3 特异性细胞杀伤,指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。,PE DT,2.2 基因治疗的种类,基因导入的方式 ex vivo 途径 in vivo 途径 按靶细胞 生殖细胞基因治疗 体细胞基因治疗,2.2.1 基因导入方式,直接体内疗法（in vivo） 是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 间接体内疗法（ex vivo） 是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。,2.2.1.1 直接体内疗法,是一种简单易行的方法，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其缺点是转染率较低。,2.2.1.2 间接体内疗法,间接体内疗法最常用的技术有3种 体外处理疗法： 将有基因缺陷的体细胞取出后，引入正常的基因拷贝后再送回体内； 原位疗法： 使用载体将目的基因直接导入靶细胞； 体内疗法： 将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将基因安全有效地导入。,2.2.2 靶细胞类型,生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy) 以生殖细胞为对象的基因治疗称为生殖细胞基因治疗，广义的生殖细胞基因治疗以精子、卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。 体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy) 治疗将遗传物质引入人的体细胞进行基因治疗的方法称为体细胞基因治疗。,3.2 基因治疗的基本程序,外源基因的选择与制备 载体的选择与构建 靶细胞的选择 基因转移 基因转染细胞的筛选与鉴定 回输体内,2019/8/8,45,可编辑,3.2.1 外源基因的选择与制备,外源基因 目的基因： 与致病基因相对应的有功能的正常基因 与致病基因无关、有治疗作用的基因 标记基因: 新霉素磷酸转移酶（Neo）基因 外源基因的获得 基因克隆 人工合成 PCR扩增,外源基因选择规则,3.2.2 载体的选择与构建,病毒载体： 逆转录病毒（RV) 腺病毒（AV) 腺相关病毒（AAV) 单纯疱疹病毒（HSV) 痘苗病毒（VV),非病毒载体： 脂质体法 直接注射法 受体介导基因转移 DNA-磷酸钙共沉淀 电穿孔,目前用于基因治疗的载体可分为病毒载体（利用治病基因取代天然病毒某些基因）和非病毒载体（基于DNA的人工复合物或微粒）两种。,3.2.2.1 逆转录病毒,结构基因 gag (group antigen) ：编码核心蛋白和属特异性抗原 pol (polymerase) ：编码逆转录酶 env (envelop) ：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白 LTR 调控序列 含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号,构建、包装 特点、问题,3.2.2.2 腺病毒载体,基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb 通过受体介导内吞作用进入细胞，基因导入效率高。 不整合宿主基因组，安全。 宿主细胞范围广泛。 可口服、喷雾吸入或气管内滴注。 载体容量大。 体外容易培养制备，病毒滴度较高。,3.2.2.3 常用的病毒载体 及其基因转移的特点,逆转录病毒 腺病毒 腺相关病毒 单纯疱疹病毒 基因组 正链RNA 线性dsDNA 线性ssDNA dsDNA 811 kb 36 kb 4.7 kb 152 kb 外源基因容量 8 kb 27 kb 3.5 kb 30 kb 重组病毒滴度 中 高 较低 高 靶细胞状态 分裂细胞，表面 分裂细胞或 分裂细胞或 分裂细胞或 须有特殊受体 非分裂细胞 非分裂细胞 非分裂细胞 基因转移效率 高 高 高 高 基因整合 随机整合 不整合 定点整合于 不整合 染色体19q 外源基因表达状况 短暂/稳定表达 短暂表达 稳定表达 短暂/稳定表达 安全性及其它 相对较安全 可引起炎症 无病原性 可能出现毒性反应 宿主范围广 和免疫反应 神经细胞嗜向性,3.2.2.4 脂质体,脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。其基本原理是利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移到细胞内。,3.2.3 靶细胞的选择,生殖细胞: 禁止 体细胞： 淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肌肉细胞、 肝细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞等,选择原则,3.2.4 基因转移,病毒法： 主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。 非病毒法： 物理方法显微注射、电穿孔、微粒轰击及 DNA直接注射、基因枪技术等； 化学方法磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、 脂质体融合法等。 受体介导的内吞作用,3.2.4 基因转染细胞的筛选与鉴定,抗性筛选方法： 重组载体上插入有标记基因Neo，导入受体细胞后可使其产生对G418（Geneticin）药物的抗性。 应用标记基因作为探针进行分子杂交法筛选。 外源基因表达的鉴定： 采用Northern印迹杂交：检测mRNA的表达，测定其表达产物即蛋白质的含量等方法。,3.2.5 回输体内,方式： 静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中； 将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织； 采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞； 或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。,内容,基因治疗,基因治疗的应用,3 基因治疗的应用,遗传病 替补法，导入正常基因 肿瘤 基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法 病毒性疾病 阻断病毒基因在体内的转录和翻译,3.1.1 遗传病的基因治疗,在DNA水平明确其发病原因及机制； 隐性遗传的单基因遗传病； 该基因的表达不需要精确调控； 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥生理作用； 该遗传病不经治疗将有严重后果。,遗传病基因治疗的临床研究,腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症 家族性高胆固醇血症（FH） 囊性纤维变性（CF） 粘多糖沉积症 血友病B（凝血因子IX缺乏）,ADA缺陷病的分子机制,腺苷脱氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A）和脱氧腺嘌呤核苷（dA）脱氨，生成次黄嘌呤核苷和脱氧次黄嘌呤核苷。,ADA缺陷 脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻 dATP 抑制核糖核苷还原酶活性 阻止DNA复制和修复 导致细胞死亡，对淋巴细胞毒性最强,3.1.2 恶性肿瘤的基因治疗,一、抑制和杀伤肿瘤细胞 自杀基因疗法 （TK、CD基因） 抑制癌基因的表达 （反义RNA、核酶、细胞内抗体） 恢复抑癌基因的功能 （p53、Rb基因） 抗肿瘤血管形成,二、肿瘤细胞的基因“修饰” 导入细胞因子基因 导入MHC基因和共刺激分子基因 三、调节和增强机体的免疫功能 细胞因子基因导入免疫细胞 基因修饰的树突状细胞 分泌免疫毒素的T淋巴细胞 肿瘤DNA疫苗,3.1.3 病毒性疾病的基因治疗,针对病毒: 诱导对病毒RNA的降解 抑制病毒与宿主细胞结合 干扰病毒基因组的转录起始和调控 抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成 RNA干扰技术,3.2.1 中国的基因治疗,1991.12 血友病B，凝血因子IX，逆转录病毒载体，导入患者自身皮肤成纤维细胞。 恶性脑胶质瘤，TK基因 非小细胞肺癌，逆转录病毒，IL-2,血友病B的基因治疗,逆转录病毒载体 +F cDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3 导入仓鼠细胞（CHO ）F表达； 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达； 91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。,3.2.2 基因治疗药物,2003年10月16日，拥有自主知识产权的重组人p53腺病毒注射液(Gendicine)获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书。 这是世界上第一个获得正式批准的基因治疗药物。,3.3 基因治疗存在的问题,1999年“杰辛格”基因疗法失败. 18岁的泽西杰辛格患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺失症，接受基因疗法后意外死亡。,合理性、困难性 安全性,3.4 现状及展望,基因治疗现阶段仅仅是实验性地运用于经过其他治疗无效的“绝症”； 酶及药物性的化学疗法，以及骨髓、器官移植仍然是当前治疗多种遗传病的最有效手段； 癌症的治疗仍以手术切除及化疗为主。 道路曲折，前途光明,内容,基因治疗的方法,Thank you for your attention,基因缺陷病单的产前诊断,基因病的出生干预在于产前诊断，产前基因诊断是采集胎儿羊水或绒毛细胞检测胎儿DNA的技术，但目前临床仅适用于某些单基因病。检测的时候，先把受检者的基因从羊水或绒毛细胞中提取出来。然后用可以识别可能存在突变的基因引物和PCR技术将这部份基因复制许多倍。复制后，有许多方法可以判断这部分基因是否存在突变。方法有：有特殊标记物的突变基因探针方法、酶切方法、基因芯片和基因序列检测等方法。目前已知单基因病有5000多种, 但我国目前可孕前诊断的仅有其中的20几种, 如 鱼鳞病、进行性肌营养不良、脆性X综合症、地中海贫血、脊髓性肌萎缩、雄激素受体基因异常所致疾病、型粘多糖贮积症、马凡氏病、血友病、视网膜母细胞瘤、成骨发育不全、亨廷顿舞蹈症、软骨发育不全、苯丙酮尿症、Wilson氏病、白化症、结节性硬化症等。,基因打靶技术,指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的交换，将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术。,基因增强奥运,基因增强可以有效避免一些缺陷基因，给人类的疾病治疗带来革命，但是同时也会有一些不可控的因素，比如对于运动员，基因增强很可能导致比赛公平的丧失。随着奥运会官员开始奋力应对遗传数据和运动员通过基因疗法“升级”所带来的影响，我们将可能看到，官员们会制定一套严苛的针对基因修改的规则。,核酶,1981年，Cetch和Alfman首次发现了一类具有特异性剪切RNA活性的RNA分子。 核酶具有稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。 核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合并切割其他的mRNA，效率高于反义RNA。,单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因 编码胸苷激酶（TK）催化丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）成为磷酸化的核苷酸类似物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因 将5-氟胞嘧啶（5-FC）转化为5-氟尿嘧啶（5-FU）而发挥细胞毒性作用。,自杀基因,如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因与TGF基因组成融合基因TGF-PE，或TGF - DT。 由于TGF与表皮生长因子EGF结构类似，也能与表皮生长因子受体（EGFR）结合； 故该融合基因可特异性进入并杀死高度表达EGFR的膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞。,特异性细胞杀伤,外源基因的选择原则,体内少量表达就可显著改善症状； 过高表达不会对机体造成危害； 在抗病毒和病原体的基因治疗中，所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且该序列是特异的； 肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。,逆转录病毒载体构建,去除病毒致病性结构的基因序列如逆转录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之； 保留其基因的调控序列及包装序列等； 插入标记基因如Neo基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。,包装细胞,指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系. 这种细胞因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（序列）而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。,假病毒颗粒,当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和目的基因的RNA，含有两端的LTR和包装信号，被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒。 因包装的RNA中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种病毒只有一次感染能力，即在感染细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒。 假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。,逆转录病毒载体的特点,1. env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受体，基因转移效率更高； 2. 结构基因gag、env、pol的缺失不影响其他部分的活性； 3.