《DNA复制医学》PPT课件.ppt

第 三 篇 基 因 信 息 的 传 递,Watson and Crick,M. Wilkins,Rosalind Franklin,DNA,RNA,复制,中心法则（The central dogma）,复制,逆转录,转录,翻译,蛋白质,F. Crick,第 十 章 DNA 生 物 合 成(复制) DNA Biosynthesis (Replication),学习目标,掌握：DNA复制的基本规律 掌握：DNA复制有关的酶和蛋白质因子 理解：原核和真核DNA复制的过程及二者间差异 掌握：逆转录的过程及意义 理解：DNA突变的分子类型及DNA损伤修复方式 了解：DNA的其他复制方式,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,第一节 复制的基本规律,Basic Rules of DNA Replication,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),一、半保留复制是DNA复制的基本特征,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,半保留复制的实验依据,N15-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,N14-DNA,N15-DNA,对照,（二）半保留复制的意义,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,(一)原核生物细胞：,有一个固定的复制起始点 (origin),二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制,(二)真核生物：多起始点，双向复制,复制叉,5,半不连续复制产生的原因？,三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续合成而随从链不连续合成，就是复制的半不连续性。,第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、DNA复制的化学反应,，,，,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,参与DNA复制的物质,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,二、 DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1、53 的聚合活性 2、核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,原核生物的DNA聚合酶,，,，,，,，,DNA-pol （109kD）,一条多肽链，二级结构以螺旋为主,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol ,Arthur Kornberg,A. Kornberg & R. Kornberg,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶,大片段/Klenow fragment,604 amino acids(氨基酸),DNA 聚合酶 5 核酸外切酶,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,不同生物体各种DNA聚合酶具有共同的特点,1、以dNTP为原料 2、合成DNA 新链具有模板 依赖性，严格遵循碱基配对规律。 3、新链的延长只可沿5 3方向进行 。催化核苷酸以3， 5磷酸二酯键相互连接 4、DNA 新链生成需引物的3OH末端延伸DNA链，而不能从头合成DNA链,三、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 引物酶(primase) 合成一段RNA，提供3-OH作为复制的引物。 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,解螺旋酶,SSB,防止DNA缠绕，打结。,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链,解链过程中DNA的缠绕、打结,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶,切断双链中的一股，并封闭切口，不需要水解ATP,拓扑异构酶 ,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,拓扑酶的作用方式：,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,四、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,T4 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶,DNA连接酶在复制中起最后连接缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 基因工程中连接目的基因和载体,功能,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第 三 节,（一）复制起始：DNA解链形成引发体,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1. DNA解链,2. 形成引发体,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,3. 合成引物,(二) 复制的延伸,子链延伸方向：5 3,在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个 加入，不断形成磷酸二酯键的过程,领头链的合成,领头链的合成,随从链的合成,随从链的合成,随从链模板DNA的折叠环绕,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,DNA-pol ,dNTP,5,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,3. 增殖细胞核抗原(PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,1. 多起始点，多复制子、复制的时序性,2.复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,1、引物和冈崎片断比原核生物短 2、核小体的解聚与重新装配 3、酶催化速率比原核慢，但由于是多复制子复制，总体速度并不慢,（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题,切除引物的两种机制,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒的功能：,维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性,端粒的结构特点：,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,端粒酶催化端区TG链的合成 5TTTTGGGGTT TTG-OH 3 CAAAACCCCAAAA 端粒酶 G C G A 3A A 5 结合、聚合、杂交 5TTTTGGGGTTTT Gggg t t t t g 3 CAAAACCCCAAAAC G A G A 3 5,TTTT 移位 G G G g G g G g 5TTTT t t t t g 3 CAAAACCCCAAAAC G A G A 3 5 终止 5TTTTGGGGTTTTG g g g t t t t g g g g t t t t g-OH 3,5TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t t t g-OH 3 3 5TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t 3 HO- g g g g t t DNA pol 5TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t 3AAAACCCCAAAACCCC AAAA g g g g t t,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性：,逆转录和其他复制方式,第四节,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),一、逆转录病毒和逆转录酶,Temin,Baltimore,Peyton Rous 1966 Nobel prize winner for his discovery of tumour inducing viruses（1911） 1970, Temin and Baltimore The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975,Rous,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制(rolling circle replication),三、滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) & Repair,第五节,DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNA damage)。 从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,（一）突变是进化、分化的分子基础 （二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性 （三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础,一、突变在生物界普遍存在,(一) 物理因素：辐射,嘧啶二聚体,二、多种化学或物理因素可诱发突变,(二) 化学因素：化学诱变剂,(一) 错配 Hbs：Glu Val,镰形红细胞贫血,三、引起突变的分子改变类型有多种,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,（二）插入、缺失,0-Thalassemia(地中海贫血) 0 Thalassemia,Lepore血红蛋白症,（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸