《实验沉淀反应》PPT课件.ppt

实验二 沉淀反应,定义： 可溶性Ag + 相应Ab 形成肉眼 可见的沉淀物质 （Ag-Ab复合物）,实验内容,对流免疫电泳 双向琼脂扩散试验,试剂和器材,双扩实验： 标本1、标本2、阳性对照、阴性对照、Ab （抗白蛋白）、 1.2%的琼脂、湿盒、37度温箱等 对流实验： 对流Ag、Ab（抗白蛋白）、pH8.6的巴比妥缓冲液、 1.2%的琼脂、电泳仪、电泳槽、加样器,双向琼脂扩散试验,原理： 定性试验。将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，抗原抗体从孔内向四周扩散，在两者对应比例适宜处形成沉淀线。 意义：可用已知抗原（抗体）来检测未知的抗体（抗原），同时检测抗原抗体的纯度。临床上常用来检测甲胎蛋白（AFP），作为原发性肝癌等的辅助诊断。,实验方法,（1）制板：4ml/块 （2）打孔：孔径3mm，孔间距5mm。 （3）加样 （各10ul）： ：标本 1 ：标本 2 ：阳性对照 ：Ab （4）扩散：置湿盒37C、24小时观察结果。,2,3,1,1,2,3,实验方法,（1）制板：4ml/块 （2）打孔：孔径3mm，孔间距5mm。 （3）加样 （各10ul）： ：标本1 : 标本2 ：阴性对照 ：阳性对照 ：Ab （4）扩散：置湿盒37C、24小时观察结果。,5,6,1,4,2,6,4,2,3,1,5,3,结果判断,1.在阳性对照孔与中间的抗体孔之间出现一条或多条白色沉淀线（一对抗原抗体系统即可出现一条沉淀线，如有多对抗原抗体可出现多条沉淀线）。 2.观察标本孔与中间的抗体孔之间有无出现沉淀线，有即为阳性，无即为阴性。,对流免疫电泳,原理： 利用电场的作用加强和加快双向扩散的一种方法。 在pH8.6的碱性缓冲液琼脂中进行电泳，带有较多负电荷的Ag泳向阳极，而Ab球蛋白等电点偏高（约为6-7），在pH8.6时带负电荷较少，加上分子量较大，泳动慢，受电渗（指电场中液体对固体支持物的相对移动）干扰后向阴极倒退，这样抗原抗体作相对运动，在较短时间内即可相遇，在孔间两者分子比例合适的地方形成沉淀线。,实验方法 （1）制板：吸取融化的热琼脂4ml，均匀加在平坦的载玻片上，待 冷却后再移动。 （2）打孔：孔径3mm，孔间距5mm,（3）加样 （10ul）： 1. Ag 2.Ab （4）电泳: 稳压100V, 30min。 （5）结果观察：在Ag和Ab之间出现一条白色沉淀线。,+,1,2,结果判断,1. 有沉淀线：+ 无沉淀线：- 2. 沉淀线的位置与Ag、Ab分子电荷情况有关，也与 Ag、Ab比例有关。 3. 特点： 优：操作简便，观察结果快，敏感度比双扩高8-16倍。 缺：分辨率差，当有多种Ag、Ab 系统存在时，形成 的沉淀线位置易重叠，难以分辨，所以用此目的 时，不如双扩。,意义： 对流免疫电泳主要用于检测标本中的抗原如AFP、HBsAg等。本法较双向琼脂扩散时间大为缩短（一般只需30分钟到1小时），且灵敏度比双扩高约数十倍。,注 意 事 项 1、浇琼脂板时注意动作要迅速