发酵工程技术实验指导书.docx

发酵工程技术实验指导书适用课程：发酵工程技术目录实验一 酵母菌的分离和纯化1实验二 果酒制作及酒精度测定3实验三 乳酸菌的分离和鉴别6实验四 酸奶制作以及感官鉴评9实验五土壤中产醋酸菌种的分离筛选11实验六 发酵型虾酱的生产实验及氨基酸态氮的测定13 实验一 酵母菌的分离和纯化一、实验目的应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。二、实验原理大多数酵母菌为腐生，其生长最适pH为4.56，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。三、实验材料及试剂 1、成熟葡萄或苹果等果皮2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、蒸馏水（1000ml），分装三角瓶。配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200 g并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。（3）在115条件下高压灭菌20分种。 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水（1000mL），分装三角瓶。 4、0.1%美蓝染液：0.1g美蓝溶于100mL蒸馏水中。 5、生理盐水四、主要仪器设备高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1ml的无菌吸管、18*180mm试管、培养皿、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。五、实验方法l、接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装100mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分搅拌后，用无菌移液管吸取1mL接入到9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置2830，培养24小时。（每组转接3支试管）2、加富培养：用无菌移液管吸取上述培养后培养液1mL，注入另一管9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置2830再培养24h。3、镜检观察：用无菌操作法用接种环取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原，菌体不着色。4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌移液管吸取0.1mL加富培养液到平板中，涂匀后2830培养24h。5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。 6、 镜检：挑取单菌落，制片观察形态。7、 挑取单个纯菌落，每组转接3支斜面试管，备用。六、实验结果的观察及记录时间观察并记录试管1试管2试管31第一次接种后观察试管内培养液的情况2加富培养后观察试管内培养液的情况镜检培养液内菌的形态结构粗略判断是否为酵母菌3分离纯化后观察培养皿内菌落形态七、实验注意事项1、配制培养基时，对培养基加热时应注意不断搅拌，防止琼脂的糊底与暴沸。2、灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。3、接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。实验二 果酒制作及酒精度测定、实验目的 了解果酒酿制原理并掌握苹果酒酿制技术。二、实验原理 果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。 本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。三、实验材料及试剂 1、菌种：已分离纯化的酵母2、药品试剂蔗糖，亚硫酸钠，果胶酶，柠檬酸苹果汁培养基：粗滤新鲜果汁（蔗糖调至13Be，酸度0.5%以下）1000ml，K2HPO4 0.1g，MgSO47H2O 0.1g，配好后，加热煮沸35分钟，静置10小时以上，过滤、分装三角瓶和试管，115灭菌20分钟。四、仪器设备1mL、10mL吸管、300mL三角瓶（发酵缸）、果汁分离器、离心机、接种环、酒精灯、无菌超净台、恒温培养箱、显微镜、电热鼓风干燥箱、糖度计、菜刀、案板、载玻片、盖玻片、电子天平、烧杯、高压蒸汽灭菌锅等。五、实验步骤（一）酒母培养 1、菌种活化（一级种）：按无菌操作法取一环酵母菌接种于装有10mL 灭菌苹果汁培养基的试管中，混匀后置2830下培养25天，镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。2、母发酵剂制备（二级种）：接12mL一级种于装有100mL苹果汁培养基的三角瓶中，于28下培养23天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。3、生产发酵剂的制备（三级种）：方法与母发酵剂相同，一般采用300mL的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积1/23/5的果汁培养液，灭菌冷却后，按10接种量接入母发酵剂，在2528下培养2448h，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。 （二）果酒生产 工艺流程如下：果胶酶、Na2SO3、柠檬酸 苹果分选清洗破碎压榨粗果汁过滤除果楂、苹果酸、丹宁 离心活化酵母母发酵剂生产发酵剂 澄清果汁 蔗糖 发酵除渣后发酵原酒操作要点：1、分选：取成熟苹果，除去腐烂、干疤和伤果。2、清洗：清水充分洗涤，除去果皮上的污物、杂质及药剂，以保证原料干净卫生。3、破碎：为易于压榨，提高出汁率，需进行破碎。用破碎机破碎至果块粒度0.5cm3左右，并除去果籽。4、压榨分离：破碎后立即进行压榨分离，分离出的果汁中不得夹带果肉。然后加入0.10.15g/L的果胶酶和果汁量0.02的亚硫酸钠。混合均匀后静置20min。5、离心：转速3000r/min，离心10min。6、澄清果汁：用柠檬酸调整总酸含量为5g/L左右，蔗糖调整糖度含量为15-23%。总酸度的测定：用移液管吸取澄清果汁10mL于250mL锥形瓶中，加50mL蒸馏水，置电炉上加热至沸，取下待冷却后加入2滴酚酞指示剂摇匀，用0.1mol/LNaOH标注溶液滴定至终点，记录NaOH体积（mL）。结果计算：X=cV0.06405/10.00式中X总酸含量（以柠檬酸计），g/ml；cNaOH标准溶液浓度，mol/L；0.06405换算为柠檬酸的系数，即1mol/LNaOH相当于柠檬酸的质量，g/mmol； V-消耗氢氧化钠的体积，mL；10.00样品制备液取用量，mL7、前发酵：取经干热灭菌的300mL三角瓶，加入占容积的45的澄清果汁，添加35的酵母生产发酵剂进行发酵，保持品温在1822之间，最高勿超过25，发酵应在712天内结束。8、后发酵：前发酵结束后，迅速将酒液与沉渣分离，酒汁转入经干热灭菌的三角瓶中，进行后发酵，使残糖继续分解。期间，控制品温在1822之间，不要超过25，时间1个月，即得原酒。要求残糖含量小于2gL以下，总酸（以苹果酸计）大于5gL。用酒精计测原酒酒度。酒精度的测定方法：取一清洁的100mL容量瓶，用被测试样荡洗23次。然后注满至近刻度，将容量瓶置于20水浴中2030min，用20试样补足至刻度。将试样移入500mL蒸馏瓶，用50mL冷水分3次冲洗容量瓶，洗液一并移入蒸馏烧瓶。将烧瓶接入蒸馏装置。用装试样的原容量瓶作为接受器进行蒸馏。为防止酒精挥发，在气温较高时蒸馏，应将容量瓶浸入冰水浴中，并使应接管出口伸入容量瓶的球部。当蒸馏液体积达到容量的9598%时停止蒸馏。用少许水洗涤应接管的头端，洗液并入容量瓶。塞好容量瓶，摇匀。如在刻度以上瓶颈沾有液滴，小心用少许水洗下。置容量瓶于20水浴中30min，并用清洁的洗瓶加同样温度的水至刻度，再次摇匀。用酒精计直接测定蒸馏液酒精度（结果仅要求达到一位小数）。五、实验结果项目色泽气味糖度酸度酒精度结果六、思考题 1、酵母菌酿酒的原理是什么？ 2、分别阐述Na2SO3和果胶酶的作用。 实验三 乳酸菌的分离和鉴别一、实验目的了解和掌握乳酸菌的菌种特性；初步掌握乳酸菌分离的一般方法。二、实验原理乳酸细菌科属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科，根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。微需氧、厌氧或兼性厌氧，在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。含乳酸菌的样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。较简便的活力测定包括凝乳时间、产酸和活菌数量等指标的检测。三、 实验材料及试剂1、实验材料：市售含活乳酸菌的酸奶。2、BCG牛乳培养基：（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿（B. C. G）乙醇溶液1mL，80灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8（用1N NaOH或1N HCl调pH），121湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。3、生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。4、脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液或者脱脂乳粉与5%蔗糖水按照1:10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115灭菌15min。5、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯6、0.1N氢氧化钠标准溶液7、1%酚酞指示剂 ：1g酚酞溶于95%酒精，定容至100mL四、仪器设备超净工作台、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜显微镜、碱式滴定仪、天平、培养皿、1mL、10mL移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接种针、涂布器、载玻片、涂布棒、250mL三角瓶、滤纸条等。五、实验方法与步骤（一）乳酸菌的分离1、菌悬液的配制：取一洁净三角瓶，盛以225mL生理盐水；6支洁净试管，各盛9mL的生理盐水；加塞包扎于121高压蒸汽灭菌20min，得到无菌生理盐水。将酸奶样品搅拌均匀，用10mL无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中，充分振摇，使样品均匀分散，即为1:10的均匀稀释液； 将6支装9mL生理盐水的无菌试管，依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取1mL无菌移液管吸1:10的菌悬液沿管壁徐徐注入装有9mL灭菌生理盐水的试管中，稀释混匀便得到1:100稀释液，按上述操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。根据样品情况，制得10-310-7的稀释液。2、倒平板：取无菌平皿9个，编号标明10-5、10-6、10-7各三套；按无菌操作将经高温消毒冷却到50左右的培养基注入9个平皿，每皿约15mL；转动平皿，使培养基均匀分布在皿底，待凝固。 3、检样的吸取：用三支1 mL无菌移液管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各0.1 mL，对号接入与之对应的3个无菌平皿中，尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20min；待样液吸收后倒置平皿于40恒温箱中培养48 h。4、菌落观察：取出已培养48 h培养平皿；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出典型的乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。5、镜检：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片，经革兰氏染色后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。（二）乳酸菌的鉴别1、 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40培养824h。 2、观察与测定：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行革兰氏染色，显微镜检查。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。 （1）观察并记录各试管的凝乳时间（2）酸度测定：用NaOH滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度滴定酸度：吸取10ml牛乳，置于250ml三角瓶中，加入20ml水，再加入0.5m1 0.5%的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用0.1 N氢氧化钠标准溶液滴至微红色（见注），在 1 min内不消失为止。消耗 0.1N氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，即得酸度（T）。 注：滴定酸度终点判定标准颜色的制备方法如下。取滴定酸度测定的同批和同样数量的样品如牛乳10ml，置于250 ml三角烧瓶中，加人20ml蒸馏水，再加入3滴0.005%碱性品红溶液，摇匀后作为该样品滴定酸度终点判定的标准颜色。 其他产品酸度滴定的标准颜色的制备，可根据其标准滴定酸度测定的取样量和加水稀释量的总容积，参照本方法按比例增加或减少0.005%碱性品红滴数即可。（3）计数：采用倾注平板法，测定菌落数量六、实验结果1、菌种培养观察并记录结果时间观察并记录10-510-610-748h菌落观察镜检形态2、脱脂乳发酵观察与测定时间/h凝乳状态酸度测定活菌计数24七、 革兰氏染色注意事项： 1、涂片不宜过厚，且应将它涂均匀，如果太粘稠就用无菌水进行稀释，这样更能观察细菌的形态。 2、染色过程中，染液要覆盖菌体，用水冲洗时应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释影响染色结果，且水流不宜过大，以免菌体被冲走。 3、染色成败关键是脱色的时间，时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌也会被染成革兰氏阴性菌。另外，时间长短还与涂片薄厚、乙醇用量有关。染色不宜过深，这样不利于观察细菌的形态实验四 酸奶制作以及感官鉴评一、实验目的了解酸乳的制作方法二、实验原理酸乳是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。由于乳酸菌的作用，牛奶中的乳糖被降解产生乳酸，随着pH的下降，达到牛奶中酪蛋白的等电点后，则牛奶的溶解度降低，蛋白质变性凝固，从而使牛奶成凝乳状态。同时，通过发酵还可形成乙醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸等，赋予酸奶特有的香味和风味。三、实验材料及试剂1、已分离乳酸菌、脱脂乳粉、蔗糖等。2、酸度测定所需试剂 0.5%的酚酞乙醇溶液：0.5g酚酞溶于95%乙醇，定容至100ml0.1 N氧化钠标准溶液0.005%碱性品红溶液：取0.005g碱性品红加少量乙醇溶解，再加水定容至100ml四、仪器设备恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、折光仪、试管、300ml三角瓶、250ml三角瓶、10ml吸管、碱式滴定仪、保鲜膜、酒精灯、烧杯等五、实验步骤1、基料配制：将脱脂乳粉、蔗糖和水以10：5：70的比例混合。2、巴氏杀菌：通常在6065下保持30min。3、牛乳冷却：牛乳经巴氏杀菌后用水冷却，至4045时接种。4、菌种扩大：分离到的乳酸菌用上述培养基料50mL进行扩大培养。5、发酵：经培养好的乳酸菌液以5% 的接种量接入上述培养基料100mL中，摇匀，以保鲜膜封口。接种后置于40恒温箱中培养至凝乳块出现（约34小时），然后转入4冰箱中后熟（24小时以上），使酸度适中，凝块均匀细腻，无乳清析出，色泽均匀，无气泡，获得较好的口感和特有风味。6、酸奶感官检验及固形物含量及酸度测定：测定结果应符合下列参数要求。项 目纯酸牛乳色泽呈均匀一致的乳白色或微黄色组织状态组织细腻、均匀，允许有少量浮清析出；果料酸牛乳有果块或果粒滋味和气味具有酸牛乳固有的滋味和气味酸度（T）70-110固形物含量（%）11.50折光计法测定固形物的方法：1、样品处理：将试样充分混匀，用四层纱布挤出滤液，弃去最初几滴，收集滤液供测试用。温度控制在20。 2、 样品测定：（1）测定前按说明书校正折光计。 （2）分开折光计两面棱镜，用脱脂棉蘸乙醚或乙醇擦净。 （3）用末端熔圆之玻璃棒蘸取处理后之样品23滴，滴于折光计棱镜面中央（注意勿使玻璃棒触及镜面）。 （4）迅速闭合棱镜，静置约1min，使样品均匀无气泡，并充满视野。（5）对准光源，通过目镜观察接物镜。调节指示规，使视野分成明暗两部分，再旋转微调螺旋，使明暗界限清晰，并使其分界线恰在接物镜的十字交叉点上。读取目镜视野中的百分数或折光率，并记录棱镜温度。 （6）目镜读数即为可溶性固形物的百分含量。 注：同一样品两次测定值之差，不得超过0.5%。六、实验报告将发酵的酸奶评定结果记录于下表中。项目凝乳情况乳清淅出粘度表面气泡表面光泽酸度香味异味固形物结果结论七、思考题酸乳发酵过程中为什么会引起凝乳？实验五土壤中产醋酸菌种的分离筛选 一、实验目的从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株，加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二、实验原理：分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富集技术。同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。产醋酸菌种在含有一定量碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养后，形成混浊半透明状态。根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小以及滴定结果，判断产醋酸能力的大小。三、实验材料及试剂牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0克，蛋白胨10.0克，氯化钠5.0克，琼脂20克，蒸馏水1000mL，pH7.27.4 产醋酸菌分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基灭菌后，加入5%无菌碳酸钙和0.03%无水乙醇。0.1moL/LNaOH、5%三氯化铁溶液（质量比）、碳酸钙土样浸出汁制备：称取5g在105115下烘干的土壤样品，放入50mL干燥的锥形瓶中，加入25mL 0.5mol/L的碳酸氢钠浸提。用玻璃棒把土壤搅散。再加入半药匙活性炭，剧烈振荡12min后静置510min，过滤后得到土壤浸出液。四、仪器设备全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管、试管、小铲、天平、涂布棒、酒精灯 五、实验步骤 1、采样：选取离地面515 cm处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 2、 增殖：称取0.5g土样（湿重），加到含10mL无菌土样浸出汁的试管中，于26条件下培养25min。3、增菌液的稀释：用一支1mL无菌吸管吸取1mL制备好的增菌液，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，振摇制成10-1增菌液，按照10倍递增稀释分离法进一步制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6增菌液，注意每递增稀释一次即换用一支1mL吸管。4、吸取稀释液：根据样品情况，选取10-4、10-5、10-6三个稀释度培养液，分别吸取0.1 mL涂布于土浸出汁平板，每个稀释度做三个平行。待样液吸收后倒置平皿于26下培养410天，将长出的菌落接入斜面。 5、分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。 初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行培养，如果细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中37深层培养24 h后。取出培养液5m1加入试管内，加0.1moL/LNaOH液中和至pH为7.0，然后加5%氯化铁液23滴，摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无红褐色沉淀生出，根据所消耗的NaOH量确定产物醋酸的具体生成量。六、实验结果菌 株123456NaOH的消耗量（ml）醋酸的生成量（ml）反应液颜色变化七、思考题如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？实验六 发酵型虾酱的生产实验及氨基酸态氮的测定一、实验目的学习和掌握传统虾酱制作整体工艺过程，了解虾酱质量卫生标准，灵活应用食品感官鉴赏原理评价产品质量，懂得产品开发的基本程序，建立质量安全意识。二、实验原理发酵法生产的虾酱味道鲜美风味独特，深受沿海、港澳台以及东南亚地区人民的喜爱。在高浓度食盐的作用下腐败微生物受到抑制而有益微生物的活动分泌的酶与虾体内存在多种自溶酶能将鲜虾的蛋白质等分解为各种呈香呈味氨基酸、有机酸、酯类等小分子物质以构成发酵型虾酱特殊的风味。三、实验材料与器具鲜虾、食盐、水、五香粉、白酒、36%甲醛、0.050mol/L氢氧化钠标准溶液、10mL微量滴定管、100mL容量瓶、5.0mL、20.0mL移液管，烧杯、量筒、玻璃发酵缸、磁力搅拌器、酸度计四、制作方法与步骤1、原料处理：新鲜海虾用清水洗净沥干水分，称重；2、五香食盐的准备：称取虾重3035%食盐、0.