聚己内酯多孔支架的表面修饰及其对内皮细胞增殖能力的影响

单位代码 10006 学 号 10101001 分 类 号 Q81 毕业设计(论文)聚己内酯多孔支架的表面修饰及其对内皮细胞增殖能力的影响 院（系）名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名范 睿 指导教师牛旭锋2014年5月聚己内酯多孔支架的表面修饰及其对内皮细胞增殖能力的影响范睿北京航空航天大学北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 VIII 页 北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：聚己内酯多孔支架的表面修饰及其对内皮细胞增殖能力的影响。 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：使用的原始数据来源于相关科技文献，其中包括了制备胶原海绵的相关内容、聚己内酯支架性质研究的相关内容、聚己内酯支架与胶原结合的相关内容、血管内皮生长因子性质检测方法相关内容、HUVEC细胞培养方法相关内容。技术要求是制备胶原和海绵并使其附着于聚己内酯支架内表面（支架已存在）。 、毕业设计（论文）工作内容：本课题研究内容主要包括：第一部分是支架的胶原化。聚己内酯支架并不具有生物活性，且对于生长因子的吸附性能也不尽人意。有大量的研究显示胶原海绵经常作为各种生长因子的载体，并且具有很好的细胞吸附性。对于支架的胶原化主要采用方法为冷冻干燥法，即通过冷冻干燥胶原悬浮液来制得。由冷冻干燥获得的胶原海绵的孔隙结构属于冰晶结构。在冷冻干燥过程中，水分的升华引起胶原聚集物分子间的交联作用。主要造作过程为将胶原溶液或凝胶在8075冷冻12小时，在冷冻干燥机中冷冻干燥24小时后则形成胶原海绵。在不同文献中提到的制备胶原海绵的冷冻时间有所差别（12小时、8小时或者5小时等），冷冻干燥机的真空压力也不尽相同。此方法步骤简单，操作较方便，不混入化学杂质。但是缺点是胶原海绵交联程度一般，力学强度低。第二部分是人脐静脉血管内皮细胞在支架上的接种研究。人脐静脉血管内皮细胞的培养相比于癌细胞要困难很多，其要求更优越的环境以及更严格的无菌操作。将细胞接种在支架上需要通过预实验确定接种数量，以及让细胞吸附在支架上的最少时间等关键因素。第三部分则是检测VEGF对人脐静脉血管内皮细胞增殖能力的影响。此实验需要将支架上加载血管内皮生长因子并将人脐静脉血管内皮细胞接种于其上，培养一段时间通过MTS方法检测细胞增殖情况。 、主要参考资料：1 Xiao C, Zhou H, Liu G, et al. Bone marrow stromal cells with a combined expression of BMP-2 and VEGF-165 enhanced bone regenerationJ. Biomedical Materials, 2011, 6(1): 015013.2 Young S, Patel Z S, Kretlow J D, et al. Dose effect of dual delivery of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein-2 on bone regeneration in a rat critical-size defect modelJ. Tissue Engineering Part A, 2009, 15(9): 2347-2362.3 Patel Z S, Young S, Tabata Y, et al. Dual delivery of an angiogenic and an osteogenic growth factor for bone regeneration in a critical size defect modelJ. Bone, 2008, 43(5): 931-940. 生物与医学工程 院（系） 生物工程 专业类 101011 班学生 范睿 毕业设计（论文）时间：自 2014 年 1 月 8 日至 2014年 5月 31 日答辩时间： 年 月 日 成绩 指导教师： 牛旭锋 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）：无 教研室主任 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。 本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：范睿签字：时间： 2014 年 5 月聚己内酯多孔支架的表面修饰及其对内皮细胞增殖能力的影响 学 生：范 睿 指导教师：牛旭锋摘 要在组织工程中聚己内酯多孔支架受到了高度的关注，但是因为缺乏生物活性所以限制了其很多方面的应用。本研究的目的是对聚己内酯多孔支架进行生物功能化的修饰，并检测其对内皮细胞增殖能力的影响。应用冷冻干燥法制备胶原海绵，并设计支架胶原化方法使得支架内部和表面填充胶原海绵。利用扫描电镜对支架孔隙和外表面进行检测，从而确定胶原化方法可行性。将50L浓度为 0.1g/L的血管内皮生长因子加载在支架上后，发现其可以促进内皮细胞增殖，但是用量为50L 0.02g/L的血管内皮生长因子不能促进内皮细胞增殖。所以此实验结果说明聚己内酯多孔支架在体外经胶原化并加载5g血管内皮生长因子后可以促进内皮细胞增殖，证明血管内皮生长因子仍具有生物活性，而过低浓度的生长因子则不会对内皮细胞增殖能力产生影响。关键词：聚己内酯多孔支架、胶原化、血管内皮生长因子、细胞增殖Bioactive functionalization of porous poly(-caprolactone) scaffold and its effect on proliferation of endothelial cellsAuthor: Rui FanTutor: Xufeng NiuAbstractPoly(-caprolactone) (PCL) has received considerable attention in tissue engineering. However, the lack of bioactivity of PCL limits its application. The aim of this study was to functionalize the porous PCL scaffold with bioactivity and to investigate its effect on the proliferation of endothelial cells (ECs). Freeze drying method was used to make collagen sponge. Scanning electron microscope (SEM) measurement demonstrated the porous PCL scaffold was successfully coated with collagen sponge inside and outside by designed method. The collagenic porous PCL scaffold bounded with 50L 0.1g/L Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) increased proliferation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs). However, the effect on proliferation of HUVECs was not observed with low concentration of VEGF (50L 0.02g/L). Therefore our finding demonstrated that porous PCL scaffolds functionalized through collagen sponge with 50L 0.1g/L VEGF can improve the proliferation of HUVEC but too low concentration of VEGF cannot have effect on it. Key words: Poly(-caprolactone), collagen sponge, vascular endothelial growth factor, proliferation目 录1绪论11.1课题背景11.2研究目的和意义31.3国内外研究状况41.3.1双因子释放系统的研究41.3.2制作胶原海绵71.3.3胶原海绵/凝胶和VEGF91.3.4具有胶原覆盖的PCL支架和聚乳酸支架101.3.5 VEGF体外生物活性检测102聚己内酯多孔支架的表面修饰122.1前言122.2实验部分132.2.1试剂材料132.2.2支架表面修饰方法132.2.3实验测试仪器142.3结果与讨论143表面修饰的聚己内酯支架对内皮细胞增殖能力影响的检测183.1前言183.2实验试剂与材料193.3实验方法193.3.1人脐静脉内皮细胞的培养193.3.2内皮细胞增殖能力的检测203.3结果与讨论20结论与展望24致 谢25参考文献26北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 31 页 1绪论1.1课题背景现在骨支架材料被大量的应用于实验研究，希望应用工程设计的骨支架替代物寻求骨的再生，从而减少自体移植和同种异体移植的治疗方法1。从现在的研究显示小面积骨缺损中，利用支架材料使缺损愈合的恢复性良好，使人们对临床骨修复充满信心。但是大面积骨缺损的治疗主要还是依赖于自体移植，骨支架并不能起到有效作用，其主要原因是大面积的骨支架在移植到骨缺损部位后因营养供应不足导致支架部位骨生长速度缓慢并且生长后的骨会发生坏死，其次大面积的骨支架移植更容易引起生物相容性问题2。另外一个有前景的治疗方法则是自体内预先构建骨支架即异位成骨，所以为了使异位成骨的骨量可以在短期内有较好的结果，需要着重于支架的生物功能化。在支架上仅添加促骨生长因子经动物实验后得到结果一般，为了进一步优化短期内骨的生成量，则需要其它生物因子的配合。生长因子的相互配合应最大化的符合其在人体内的生理状况，经长期研究表明，骨组织的生长过程极其复杂，其中伴随多种生长因子的分泌与释放。现在被大多数学者认可的是骨生长过程中血管的生长发生是必不可少的环节，血管的发生可以促进骨的生长，二者的作用相辅相成，这一点在组织工程中也渐渐受到重视3,4。生理骨修复的过程包括血肿形成（在受伤后，受伤的血管组织很快形成血肿），软骨痂的形成（在破损血管的部位会有新血管生成，也称血管发生。同时伴有外骨痂和内骨痂的形成，形成外骨痂的过程称为膜内成骨，内骨痂也称为纤维软骨），硬骨痂形成（骨痂进行矿化，形成编织骨的硬骨痂），骨重建（大面积的骨痂由二次板层骨代替，血管供应恢复正常），过程如图1.13。在软骨痂形成过程中血管发生有很大作用，血管为骨的生长提供足够的营养以保证骨的持续生长。所以为了进一步促进骨的生长速度，需要更好的模拟生物生理状态下骨修复过程，所以双因子释放系统应运而生。双因子释放体系含有重要的促骨生长因子骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2， BMP-2）和促血管生长因子血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF），以聚己内酯（Poly(-caprolactone)， PCL）支架为载体，同时加载两种生长因子并实现VEGF的快速释放和BMP-2的持续释放。图1.1 生理骨修复过程示意图 （a）血肿形成（在受伤后，受伤的血管组织很快形成血肿）；（b）软骨痂的形成（在破损血管的部位会有心血管生成，也称血管发生。同时伴有外骨痂和内骨痂的形成，形成外骨痂的过程称为膜内成骨，内骨痂也称为纤维软骨）；（c）硬骨痂形成（骨痂进行矿化，形成编织骨的硬骨痂）；（d）骨重建（大面积的骨痂由二次板层骨代替，血管供应恢复正常）在这个双因子释放系统中聚己内酯（Poly(-caprolactone)，PCL）具有较高力学强度，可降解，而且容易加工成复杂的具有合理孔隙度的3D结构。所以这种支架材料在组织工程中受到了很大的关注，尤其是在骨再生方向。然而PCL并不是一个具有骨诱导能力的生物材料，这也是PCL的限制性1。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生且调节血管的发展5,6。近期研究发现，此因子可以协助早期骨生长并促进支架上骨的进一步生长。受体VEGFR-2主要作用是与VEGF作用后促进内皮细胞的增值，VEGFR-1的功能研究的并不清楚，但有研究称其可以调节内皮细胞生长方向，向着管状结构发展，VEGF各个受体作用功能如图1.210。将血管内皮生长因子加载在支架材料上可以为没有生物活性的材料增添生物活性，在体内移植后可以促进局部血管的生成从而辅助骨的生成。VEGF是内皮细胞重要的促细胞分裂剂，在血管发生中其最重要的作用也是被人们研究最多的作用则是促进内皮细胞的增值。VEGF与内皮细胞受体VEGFR-2相互作用可以影响内皮细胞的增值能力，所以为了检测VEGF在体外的生物活性，现在最常用的方法则是检测VEGF对内皮细胞增殖能力的影响。另外一个方法则是观察内皮小管的形成，因为VEGF还可以促进内皮细胞的排布趋向，可以使其向管状结构发展7-11。图1.2 VEGF受体作用功能示意图10胶原海绵经常作为各种生长因子的载体，并且具有很好的细胞吸附性，降解速度较快，经常与不具有生物活性的材料结合作为复合生物材料，并加载生长因子使材料具备一定的生物活性12。双因子释放系统的研究并不是很广泛，支架载体种类主要为聚己内酯支架和聚乳酸支架，加载因子主要是促骨生长因子和促血管生长因子，研究最多的则是BMP-2和VEGF，两种因子经常为混合后再加载到支架上。实验显示，双因子释放系统中有很多因素可以影响移植后骨生成量，如运载载体的材料、生长因子的剂量比和实验检测所用的动物模型等12-18。此双因子释放系统应用于异位成骨研究，在后续实验中会将其植入到小鼠皮下组织对骨生成量进行观察，从而确定VEGF与BMP-2相结合是否会在短期内增加骨的生成量。如若骨量有较明显的变化则会进一步对双因子释放系统进行体外细胞实验以进一步研究双因子释放系统的作用机制。1.2研究目的和意义以上述研究背景为基础，整体实验目的为设计双因子释放系统以促进异位早期骨生成量。设计分为两大部分，体外和体内实验。体外实验主要包括对两种生长因子的结合释放动力学的研究以及两种生长因子分别在支架上生物活性的检测。体内实验主要包括检测双因子释放系统植入到小鼠皮下4-8周后的骨生成量、血管生长情况、以及软骨生长情况，并与单因子释放的支架相比较这些指标。简要实验设计图如下所示：表1.1 整体实验设计实验时间实验内容前期体外实验对支架上进行生物功能化结合/释放动力学研究生物活性检测BMP-2VEGFBMP-2VEGF如：酶联免疫吸附测定如：碱性磷酸酶染色如：脐静脉血管内皮细胞增殖能力变化检测，内皮细胞小管的形成后期体内实验双因子释放系统单因子释放系统骨生成量检测：如HE染色，Micro-CT血管生成检测：如血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）检测，多普勒超声，Micro-CT软骨生成检测：如番红O和快绿的软骨染色我的毕设实验是此实验中的一部分（字体加粗部分）。将VEGF加载到空白支架上后需要检测其是否还具有生物活性，若其仍具有生物活性那么在体内实验中获得的实验数据才是有参考价值的。判断VEGF的生物活性需要检测几个指标，而检测其对内皮细胞增殖能力的影响是最常用也最有说服力的检测方法。所以我毕设的实验目的就是对PCL支架表面功能化，并检测其对内皮细胞增殖能力的影响。1.3国内外研究状况针对双因子释放系统和本实验所涉及的实验方法，我对进几年左右的文献进行了整理，并总结如下。1.3.1双因子释放系统的研究现在每年有超过6.2106的骨折病例产生，这其中有5-10%的病例中的患者会在治疗过程中因为治疗方法不当或不及时最后导致骨折不愈合。如果现在不找出一个有效的方法来解决这种现状，患者们的残疾率将会大大提升，而他们的生活质量也会降低很多。骨是高度血管化的组织并且血管发生对骨再生非常重要，因为血管可以运输养分和废物，为骨的生长提供支持。骨中血管不足会导致骨形成和骨量的下降。新血管的形成在骨修复过程中会为骨髓间充质干细胞和成骨细胞提供营养，而且实验研究发现在一些骨折模型中血管发生可以促进骨的发生和生长。所以解决骨再生过程中血管发生问题是很重要的19。血管生成和骨生成这两种因子的可控制的释放系统可以模拟生物体内骨修复过程，VEGF是一种重要的促血管生长因子，在骨修复中的膜内和软骨内成骨都有很重要的作用。BMP-2是促骨生长因子，在异位和原位成骨的应用都很广泛。经调研文献它曾被用在大鼠，兔子和狗的骨折位置和缺陷处以检测其对骨生成的影响。大部分双因子释放系统的实验是在动物体内进行的，研究此系统在原位骨生成中的作用，使用的动物模型多为临界缺陷（critical size defects， CSDs）骨折模型。CSDs是一种临界体积的骨缺陷，当骨达到这种缺陷的尺寸后，其再生时不能通过自我调节生成足够的骨量而弥补缺陷的距离。大部分实验结果显示双因子释放系统相比较于单因子的应用可以促进一定时间内骨的生成，进一步研究称双因子释放系统的作用在于骨修复的早期，所以双因子释放系统可以促进骨修复的速度。Z.S. Patel et al.19的实验评价了其设计的双因子释放系统。VEGF和BMP-2加载到具有明胶微颗粒的聚丙烯酰胺poly(propylene fumarate),PPF多孔支架上以制得双因子释放系统，检测其在8mm临界大鼠颅骨缺损模型上的影响。双因子释放系统在第4周的时候对于血管生成没有明显的影响，但是骨生成量有明显增加。在第12周的时候双因子释放系统的骨生成量和只有BMP-2的实验组的骨生成量无明显差别，然而双因子释放系统实验组动物的缺损部位骨小梁结构较完整且密集。实验证明了双因子释放系统的作用在早期骨再生更加明显，也就是说其可以加快骨的愈合速度。对于双因子释放系统还有少量关于剂量对于作用程度的研究。在Young et al.20实验研究中假设双因子释放系统中BMP-2的剂量减少会导致骨量生成的减少，而这种下降会因为提升VEGF的剂量而得到抑制。在8mm临界大鼠颅骨缺损模型上进行动物实验，发现BMP-2相比较于VEGF可以更持续的释放。降低BMP-2的含量会降低最终骨的生成量，但是增加VEGF的含量并不能抑制这一趋势。在Hernandez et al.21的实验中也进行了相关双因子释放系统剂量的研究。此实验在聚乳酸微球上面加载VEGF（0.35g和1.75g）和BMP-2（3.5g和17.5g），再将微球加载到聚乳酸支架上，将其植入到兔子的股骨处进行原位成骨研究。这样设计的目的是想要控制不同剂量的生长因子的释放并保持生长因子释放部位始终在缺损部位。在第4周的时候后几乎没有发现不同剂量间两种因子的配合有什么特别的作用，在第12周实验结果显示两种因子的配合并没有起到什么明显作用。说明进一步实验应该优化VEGF的剂量、两种因子的释放顺序以及两种因子的剂量比以达到更好的双因子释放系统的效果以促进骨的再生。对于双因子释放系统在动物体内对于异位成骨影响的研究也有涉及。主要结论有之前Kakudo et al.22的研究，将VEGF和BMP-2加载在胶原水凝胶中，使其在异位成骨部位释放（老鼠的小腿肌肉）。证实了双因子释放系统的实验组在第3周时毛细血管密度和骨生成量比只有单因子BMP-2存在的血管密度和骨生成量要多。骨再生是一个受到调节的级联反应，由多种细胞因子和生长因子所控制。血管生长因子是在骨修复过程早期为了重建血管系统被表达的，与此同时促骨生长因子在骨形成和重塑过程中一直持续表达着。D.H.R. Kempen et al.23的实验目的是探究若将促血管生长因子VEGF和促骨生长因子BMP-2有顺序的释放，是否能促进骨的生成（相比较于只释放BMP-2的系统）。实验将各实验组植入到大鼠体内（包括异位成骨和原位成骨的研究）。经检测复合物在前三天VEGF会大量释放，BMP-2连续56天持续释放。尽管VEGF并没有达到促进骨生成的目的但是在异位成骨的移植中其促进了血管网络的形成。在原位移植的实验组中并没有发现血管和骨量的增加（两类实验都是与单独存在BMP-2的试验组相比较）。对于双因子释放系统的构建方法在一些文献中也有所提及。Z.S. Patel et al.19实验中构建的复合支架包括明胶微颗粒和多孔聚丙烯酰胺poly(propylene fumarate),PPF支架。在明胶微颗粒上分别吸附定量的VEGF或者BMP-2，按照实验设计的定量和比例将加载有不同生长因子的明胶颗粒混合并加载到支架上，对照组中明胶颗粒吸附的是PBS。在C Xiao et al.24的研究中，在天然珊瑚支架上加载双因子，加载方法是将VEGF和BMP-2的基因转染到兔子的骨髓基质干细胞中，再将转染后的骨髓基质干细胞加载在支架上。最后将支架植入到兔子的临界骨缺损部位进而观察双因子释放系统的作用。D.H.R. Kempen et al.23实验中的设计更加精细，因为将两种因子分别分布在复合支架的不同空间上以达到两种因子不同释放速度的目的。复合物包括聚乳酸微球，微球上面加载BMP-2，后将微球加载在聚丙烯支架上，聚丙烯支架周围包裹加载了VEGF的明胶水凝胶，这个复合物可以达到让两个因子不同速度释放的目的，VEGF首先快速释放而BMP-2缓慢长期释放，如图1.3。图1.3复合支架示意图。明胶水凝胶和PPF支架两个部分在移植进入动物体内前复合到一起。通过以上实验设计，方法和结果的总结可知现在双因子释放系统的研究还远远不足，其作用的结果受多种因素影响，如两种因子的剂量比、加载方式、释放顺序以及实验应用的动物模型。所以进一步实验应该寻找双因子释放系统的共性并结合剂量变化进一步研究。通过现象对双因子释放系统进行机制上的研究也是必不可少的一部分。1.3.2制作胶原海绵制作胶原海绵的过程中首先需要纯化胶原材料，将其溶解于酸碱度合适的水溶液或者悬浮液中（此步骤对于胶原纤维的溶胀程度和纤维结构的水解程度有很大影响）。接下来经过一系列操作使胶原溶液转变为胶原海绵，在这些方法中，最基本的就是冷冻干燥法。另外还有两种方法化学交联和物理交联可以对胶原进行交联并且相比较于冷冻干燥法这两种方法可以进一步加强胶原交联的结构稳定性25。（1）冷冻干燥法胶原海绵可以通过冷冻干燥胶原悬浮液来制得。由冷冻干燥获得的胶原海绵的孔隙结构属于冰晶结构。其原因是在冷冻干燥过程中，水分的升华引起胶原聚集物从而产生分子间的交联作用26。主要操作过程为将胶原溶液或凝胶在80至75冷冻12小时左右使胶原中的水分完全结成冰晶，在冷冻干燥机中冷冻干燥24小时后水分升华，则形成胶原海绵。在不同文献中提到的制备胶原海绵的冷冻时间有所差别（12小时、8小时或者5小时等）27-30，冷冻干燥机的真空压力也不相同，但是根据样品容量进行适当的调整，只要符合原理即可以成功制备胶原海绵31,32。（2）化学交联法化学交联物包括醛、酰基叠氮、碳化二亚胺、聚环氧树脂复合物等，比如戊二醛就是现在是用途很广泛的一种醛类交联剂。不同的交联剂的交联原理不同，结构的改变形式也不同，所以使用不同的交联剂使得胶原海绵结构稳定程度不同，使得稳定程度由小到大的试剂顺序是：氨腈二氯乙烷六亚甲基氨基甲酸二胺联氨二苯基磷酰基叠氮化物戊二醛33。经总结文献，以戊二醛为例主要有两种操作方法。其一主要操作过程为：将胶原支架放入100ml 含有0.02%或者0.2%戊二醛的0.05M的醋酸溶液中，实验条件为4，24小时，之后将处理的胶原海绵放在50mM甘氨酸水溶液中，保持温度37，浸泡1小时以阻断未反应的戊二醛醛基34。另一种较常用的方法是将胶原海绵用戊二醛蒸气处理，戊二醛蒸汽是由饱和的25%戊二醛溶液制得，将胶原海绵与蒸汽在37下反应4小时。交联后，用0.1M甘氨酸水溶液处理海绵阻断未反应的戊二醛醛基29,30。以上两个实验的戊二醛化学交联过程是比较有代表性的，所使用的实际浓度应根据实际实验目的和设计进一步设定。（3）物理交联法物理交联的方法主要包括干热交联处理，紫外线照射和射线照射25。最常用的方式是干热交联处理。在处理后用70%乙醇或者环氧乙烷对胶原海绵进行杀菌处理。物理交联方法应注意的是对生物大分子活性的影响，因为在经过干热，紫外或者射线处理后大部分生物大分子已经变性，如胶原溶液在长时间紫外照射后不能再进行交联，所以应该在考虑实验设计的前提下慎重使用物理交联方法29,30,35。1.3.3胶原海绵/凝胶和VEGF因为本实验涉及将VEGF加载在胶原海绵上的实验步骤，所以总结近期研究，主要有三种胶原与VEGF结合的方式，包括吸附，共价连接与混合。（1）吸附法VEGF溶液可吸附在冷冻干燥后的胶原海绵上，如果VEGF水溶液的容量没有超过胶原海绵的最大吸水量，那么其可以完全被冷冻干燥的胶原海绵所吸收。此方法利用胶原海绵吸水性的特征，优点是简单易行，缺点是不易定量控制VEGF的加载量34。在Kampmann A et al.36的实验中，在有胶原覆盖的聚乳酸支架上加载VEGF的步骤是将鼠科VEGF164溶于2l含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中。将此溶液逐滴滴到支架上，并在空气中干燥1618小时。（2）共价交联法共价交联法则是利用共价键将VEGF与胶原海绵相连接，VEGF在胶原海绵上稳定性较好，其释放的速度也可以等到较好的控制，但是实验引入了不同交联剂37,38。在Miyagi Y et al.37的实验中，支架浸泡于含有二氯乙烷和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中20分钟，后将支架在VEGF溶液中浸泡2小时已达成共价交联。（3）混合法混合法则指的是胶原溶液于VEGF溶液的混合，即在制备出胶原海绵的同时VEGF就已经存在于胶原海绵中了，此方法可以使得VEGF分布较为平均，但是制备过程需要严格控制条件避免VEGF的失活。在Singh S et al.39实验中体现了混合法的操作过程如下：将人源VEGF165溶液加入到中性胶原溶液中，之后将提前浸湿过的支架浸泡在混合液中，保持环境为4，过夜。取出支架后空气干燥则得到了表面加载有胶原-VEGF的复合支架。（4）胶原凝胶和VEGF应用较多的胶原的状态有海绵或者凝胶，在一些实验中应用胶原凝胶作为VEGF的载体，胶原凝胶饱含水分适合细胞的吸附与生长，但是胶原凝胶不易定型。在I. dAngelo et al.40实验中，使胶原凝胶具有VEGF活性的过程如下，首先将VEGF溶液加入到未交联的胶原溶液中（VEGF的最终浓度是70ng/ml），之后将胶原溶液放入环境为37的温箱中，24小时后获得混合有VEGF的胶原凝胶。1.3.4具有胶原覆盖的PCL支架和聚乳酸支架（1）胶原与聚乳酸支架结合法很多实验是将聚乳酸支架与胶原相结合，这个复合物既具备合成高分子的力学强度，又具备胶原海绵上生物因子所带来的生物活性28。在A. Kampmann et al.36实验中两者相结合的实验过程为：将具有特定结构的聚乳酸支架系在线上，将其在含有0.2%一型鼠尾胶原溶液中浸泡1分钟，后在空气中干燥1小时。此过程重复一遍。之后将覆盖有胶原的支架用PBS清洗1小时并在空气中干燥。将其保存在4条件下以备使用。（2）胶原与PCL支架结合法胶原与PCL支架相结合也是很多实验的研究重点。其中有一个实验所提到的结合方法是：将胶原（0.5M）和PCL（溶解在冰醋酸中）相互混合并调节酸碱度到4.2，混合的摩尔比分别为1：1，1：2，1：3和1：4，在4下不断搅拌。用扫描电镜观察所制成复合物的形貌特征41。1.3.5 VEGF体外生物活性检测经文献总结对于体外检测VEGF生物活性的方法主要有两种，其一是检测其对内皮细胞增殖能力的影响，其二是检测其是否能趋使内皮细胞形成内皮细胞小管。聚乳酸/聚乙二醇微球可以作为生物活性因子的载体，并且此载体可以在一定程度上控制生物因子的释放，在组织工程中收到重视。在King, T.W et al.42的实验中VEGF作为促血管生成因子被加载到聚乳酸/聚乙二醇微球复合体系中。实验中检测了VEGF的加载效率、释放动力学，还有体外人脐静脉内皮细胞的增殖，用以检测此复合支架上VEGF的生物活性。经检测结果显示一定量的存在于微球上的VEGF可以促进人脐静脉内皮细胞的增殖，说明体外加载在支架上的VEGF具有生物活性。同样在Richardson, T.P et al.43的实验中，在一种聚酯支架上添加两种具有不同释放动力学的因子，血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子。两种因子分别在体外进行生物活性检测，检测血小板衍生生长因子加载后的生物活性应用平滑肌细胞增值检测，检测血管内皮生长因子加载后的生物活性应用的方法是内皮细胞的增殖能力检测。同时还有一种广泛应用的方法用于检测VEGF在体外的生物活性，即内皮小管形成的实验。在J.M. Kanczler et al.44的实验中将VEGF利用超临界二氧化碳萃取的方法加载到多孔聚乳酸支架上。为了检测利用超临界二氧化碳萃取处理的VEGF是否还具有生物活性，实验应用人工基底膜管形成分析法进行检测，即在人工基底膜上接种内皮细胞，膜上含有经超临界二氧化碳萃取处理的VEGF。经过16小时细胞培养培养，利用蔡司倒置显微镜观察膜管长度以及网络的形成。实验结果发现经处理VEGF可以使内皮细胞兴成小管类似的形状说明VEGF仍具有生物活性，内皮细胞小管形成见图1.4图1.4 内皮小管形成图。A是不加入VEGF的显微镜下内皮细胞观察图；B是加入VEGF的显微镜下内皮小管观察图；C是经加入超临界二氧化碳萃取处理的VEGF的内皮小管的显微镜下图；D是对三组内皮小管长度的数据统计；E是三组内皮小管网络的数据统计2聚己内酯多孔支架的表面修饰2.1前言聚己内酯（Poly(-caprolactone)，PCL）具有较高力学强度，可降解，而且容易加工成复杂的具有合理孔隙度的3D结构。所以这种支架材料在组织工程中受到了很大的关注，尤其是在骨再生方向。然而PCL并不是一个具有骨诱导能力的生物材料，这也是PCL的限制性。所以对支架进行生物功能化有很重要的意义。在此实验中，应用的聚己内酯多孔支架是一个长宽高分别为6.3mm6.3mm4mm的多孔支架，如图2.1。为了达到令VEGF快速释放的目的，实验将支架胶原化并应用胶原海绵作为VEGF的载体，通过文件调研已知胶原海绵在体内的降解时间为1-2周，而PCL的降解时间长达1年左右。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生且调节血管的发展，血管的生长可以促进骨的生长。利用VEGF对聚己内酯多孔支架进行生物功能化并且希望此生长因子可以从支架上较快速的释放的实验过程设计是本实验的一个创新点，这个过程考虑了整体实验的实验目的和设计，还有应用过程的实用性和简便性，第二部分则是检测生长因子在支架上生物活性的实验。图2.1 聚己内酯多孔支架示意图。（a）实验所用支架的结构图；（b）实验所用支架的实物图2.2实验部分2.2.1试剂材料聚己内酯多孔支架，鼠尾一型胶原蛋白（8.97mg/ml）,Sylgard184硅橡胶，10PBS，1M NaOH，超纯水等试剂。2.2.2支架表面修饰方法1、制备硅胶模具。将两种试剂按比例10：1混合后倒入容器内，除去气泡后将与支架结构相契合的PCL圆柱体插入液体中，固定好后一并放入烤箱，将烤箱温度调整到50并维持8小时。取出盛有模具的容器放在丙酮中浸泡8小时，目的是将外部塑料溶解，后取出模具。将模具放入70%乙醇中再浸泡8小时进行消毒，取出后空气干燥。模具如图2.2。图2.2 Sylgard184硅橡胶模具实物图2、根据胶原溶液使用说明书配置1.05ml 5mg/ml的胶原中性稀释液。配置胶原中性稀释液过程中各个试剂添加顺序及计算公式如下：（1）首先确定所需制备的胶原中性稀释液的体积（V）和浓度（C）（2）加入V1体积的10PBS，计算公式：V10=V1ml （3）计算实际所需胶原原溶液的体积V2，计算公式：VC胶原原溶液浓度（瓶体上标注）=V2（4）计算所需1M NaOH体积V3，计算公式：V20.023ml=V3（5）计算所需超纯水的体积V4，计算公式：V-V1-V2-V3=V4（6）将上述体积的各种溶液混合在一起，注意最后添加胶原原溶液，并混合均匀针对本实验具体配置步骤如下：（1）首先取105l 10PBS溶液放入容器中（2）加入13l 1M NaOH 溶液（3）加入347l 超纯水（4）加入585l 8.97mg/ml 胶原溶液（5）混合均匀，放置在低温环境保存以免快速成胶3、用1PBS浸泡支架2分钟，取出支架后将其放入模具中。4、并向支架中分别注射70，80，90l胶原中性稀释液。5、将模具放入37温箱30分钟，后转入-80冰箱8小时，再放入冷冻干燥机24小时，取出后用镊子将支架取出即获得胶原化的聚己内酯多孔支架。6、分别配置0.02和0.1g/l浓度的VEGF溶液，分别滴注50l两种浓度的VEGF溶液在支架上即完成支架表面的修饰。 2.2.3实验测试仪器扫描电镜：将胶原化后的支架表面磨平，喷金后进行JEOL扫描电镜不同区域的检测，加速电压分别为是10kV和20kV。2.3结果与讨论在本阶段实验中的主要实验目的是对支架进行胶原化。实验中利用冷冻干燥法使支架表面和内部形成胶原海绵，通过扫描电镜对胶原化后的支架表面进行观察，没有对支架胶原化的优劣进行过多详细的检测评价。此阶段实验中要分为两部分，第一部分是掌握胶原海绵的制备方法并确定配置胶原中性稀释液的浓度。胶原海绵的制备方法较多，其中包括冷冻干燥法、化学交联法和干热交联法等等。选择冷冻干燥法的原因有二，其一是此制备方法不可以对支架上已存在的BMP-2的生物活性造成影响（注意，此实验中因为实验主要目的并不是研究两种因子相互作用所以支架在胶原化之前并没有吸附BMP-2，但是后面的动物体内实验中双因子释放系统的制备流程是：吸附BMP-2，胶原化，吸收VEGF，植入动物体内，所以胶原化过程后必须保证BMP-2生物活性依然存在）；其二是尽量选择简单易行的实验方法，并对体内试验不造成影响。冷冻干燥法主要包括三个阶段，37成胶，-80冷冻，-55冷冻干燥，经调查文献不同实验中此方法每个阶段的温度条件几乎一致，但是时间条件不尽相同。所以根据文献参考制定了每个阶段的最优时间段，在实验中选择最优时间段中最小的时间限度进行制备并检测BMP-2生物活性情况，最后得出实验方法为37成胶30分钟，-80冷冻8小时，-55冷冻干燥24小时。确定实验方法后进一步对胶原中性稀释液的浓度进行选择。分别设定了三种浓度0.3mg/ml、1mg/ml、5mg/ml，经冷冻干燥法分别制备1ml液体体积的胶原海绵（容器为1.5ml EP管）。可非常明显观察到相同体积的液体制备出不同体积的胶原海绵，浓度越小制备出的胶原海绵收缩越严重。并且从实物图可以看出0.3mg/ml的胶原海绵只可观察到少量的纤维，另外一部分为粉末状；1mg/ml 的胶原海绵纤维胶细，柔软；5mg/ml的胶原海绵结构较完整，收缩程度最小，如图2.2。图2.3 三中浓度的胶原海绵实物图此阶段试验的第二部分就是在应用冷冻干燥法制备胶原海绵的基础上对支架进行胶原化，实验主要目的是对支架内部填充胶原海绵以作为VEGF的载体。支架胶原化的方法使用的较多的为反复浸泡-干燥法，填充法，还有将液体高分子（支架材料）与胶原混合后进行支架制备的方法。实验选择填充法的原因有两个，其一是希望胶原海绵较多的形成于支架内部，同时在支架表面也有覆盖，这样可以增加每个支架携带海绵的体积，有助于吸收生长因子溶液。经调研文献发现因为胶原溶液在干燥后会发生一定的萎缩，所以反复的浸泡-干燥对于胶原内部海绵的形成不利，其可以在支架表面形成海绵。直接混合法从实验源头改变的实验条件与本实验目的不符合。填充法向模具中的支架内部填充足量的体积溶液，溶液在制备过程中不会流出；其二是填充法中各个变量容易控制，如注射液体积，操作过程适用于较多样本且方便操作。支架胶原化实验中根据支架的几何模型计算出内部空间理论体积，根据此体积设计了三个注射量体积70、80、90l进行实验。实验过程中注意两点，第一，因支架表面疏水，所以为了提高胶原溶液在支架内部的填充体积应对支架进行浸泡湿润；第二，利用真空泵将胶原溶液中的气泡抽出。实验结果显示三种注射量的支架内部均有胶原海绵的填充，表面也都有胶原海绵的覆盖。注射量为90l制得的胶原化支架可明显看出支架外部有大量溢出剩余海绵，所以判断为注射量过大。注射量为70l和80l的支架经扫描电镜观察发现，注射量为70l的支架空隙中胶原纤维形状较长较大，纤维分布不密集，有明显空白区域，如图2.4B。而在支架的外表面可以看到只有部分覆盖了成纤维状的胶原海绵，还有部分表面呈不规则颗粒状，其为未被胶原画面覆盖的PCL支架表面，如图2.4D；注射量为80l的支架空隙中胶原海绵纤维密集，填充情况较好，如图2.4A。在支架外表面几乎全部覆盖上了胶原海绵观察不到成颗粒状的PCL支架表面，如图2.4C。所以在最终胶原化的方法中选择80l的注射量进行实验。图2.4 胶原化后支架的扫描电镜图。（A）向支架中注射胶原中性稀释液80l 后制备成的支架孔洞处扫描图；（B）向支架中注射胶原中性稀释液70l 后制备成的支架孔洞处扫描图；（C）向支架中注射胶原中性稀释液80l 后制备成的支架外表面扫描图；（D）向支架中注射胶原中性稀释液70l 后制备成的支架外表面扫描图。3表面修饰的聚己内酯支架对内皮细胞增殖能力影响的检测3.1前言向胶原化的支架上加载VEGF后检测其是否对内皮细胞增殖能力有影响的主要目的是确定体外固定在支架上的VEGF是否还存在生物活性。对支架进行生物活性的修饰现在在组织工程中收到了很大的重视，生物因子与没有生物活性的高分子支架相结合的方式主要有化学连接，物理吸附等等。在生物因子加载到支架上后会产生与高分子支架的相互作用，主要有共价键的变换，离子键以及氢键的变换， 这些变换很有可能变换生物因子的结构甚至使其失活。所以在体外的生物大分子支架的生物功能修饰后生物因子的活性检测必不可少。血管内皮生长因子对内皮细胞增值能力的促进是广为研究者们熟知的，根据研究显示VEGF在具有活性的情况下会与内皮细胞表面的VEGFR-2号受体相结合，产生促进内皮细胞增殖的作用。同时利用内皮细胞增值能力的检测方法是检测体外VEGF是否具有生物活性的普遍方法。对人脐静脉内皮细胞增殖能力的检测主要应用的是MTS染色法。3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂。MTS 被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的。在490nm处检测到的甲臜产物的量与培