重症急性胰腺炎大鼠TNFα和ICAM1的表达及其意义.doc

重症急性胰腺炎大鼠TNF-和ICAM-1的表达及其意义【摘要】 目的 通过重症急性胰腺炎大鼠探讨TNF-和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）对本疾病的影响。方法 20只SD雄性大鼠分2组，每组10只。普通SAP组以5%牛磺胆酸钠建立重症急性胰腺炎（SAP）；病因加重组以10%牛磺胆酸钠制模。制模10h后处死大鼠，检测其血液生化和细胞因子浓度，观察组织脏器的病理变化及组织TNF-和ICAM-1的表达。结果 病因加重组大鼠血清的谷丙转氨酶、肌酐和TNF-与普通SAP组相比有明显升高。同时，该组大鼠的肝脏、肺和肾脏病理评分显著大于普通SAP组。并且其脏器组织中TNF-表达和ICAM-1的表达也明显增加。结论 TNF-及ICAM-1可能在胰腺炎重症化及MODS发生发展过程中起重要作用。 【关键词】 重症急性胰腺炎；肿瘤坏死因子；细胞间粘附分子-1 【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of TNF- and ICAM-1 on organ function of severe acute pancreatitis by establishing animal models of the disease.Methods Twenty SD rats were divided into 2 groups with 10 rats each group. The rats in group A were given retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the pancreatic duct as sereve acute pancreatitis (SAP) model. The rats in group B were given retrograde injection of 10% sodium taurocholate into the pancreatic duct. The changes in organ functions were observed by biochemistry and pathological examination was made 10 hours later after modeling, and the expression of TNF- and ICAM-1 in pancreas and other organs was examined by immunohistochemistry.Results The severe organ pathological lesion was found in the rats in group B when compared with those in rats of Group A.Conclusion TNF- and ICAM-1 may play an important role in the organ dysfunction in severe acute pancreatitis. 【Key words】 severe acute pancreatitis；TNF-；ICAM-1 重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis ，SAP）是外科急腹症中最为严重的疾病之一，死亡率极高。Isenmann1认为严重的胰腺坏死正是导致脏器功能早期发生障碍和衰竭的重要因素。胰腺组织受损激活单核-巨噬细胞系统的炎症反应，合成和释放多种促炎因子如TNF-、白介素-1等，从而刺激粒细胞活化，激活毛细血管内皮因子，启动炎症反应，诱发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)。本研究旨在通过动物实验探讨TNF-和ICAM-1对SAP的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 雄性SD大鼠20只，体重300400g，购自中科院上海分院实验动物部。牛磺胆酸钠（纯度99%），购自Sigma公司，用生理盐水配制成5和10牛磺胆酸钠溶液。谷丙转氨酶及肌酐测定试剂盒，购自上海生物制品研究所。-淀粉酶试剂盒，购自上海科华-东菱诊断用品公司。大鼠 TNF- kit:，购自Biosource公司。TNF-和ICAM-1一抗，购自Santa Cruz。抗山羊二抗，购自华美生物工程公司。主要仪器包括低温高速离心机（Beckman公司）、uQuant酶标仪（BIO-TEK公司）、DU640分光光度计（Beckman公司）、CHK2-F-GS光学显微镜（Olympus公司）、BX50病理摄片仪（Olympus公司）。 1.2 方法 1.2.1 实验模型制备和分组 20只大鼠随机分成两组，每组10只。实验前12h禁食，自由饮水。动物以乙醚吸入麻醉，正中切口进腹，找到胰胆管。于胰胆管远端用无损伤金属夹将其夹闭，近端注射5%牛磺胆酸钠，剂量为1ml/kg体重，为普通SAP组。注射时间均为60s，匀速推完，保持5min后拔出穿刺针，去除金属夹。缝合腹壁各层。加重病因组用10%牛磺胆酸钠，剂量为1.5ml/kg体重。 1.2.2 标本采制和检测 制模后10h，两组大鼠经腹主动脉采血，血液4过夜，3000rpm 4离心15min后取血清，-20保存。肝功能检查测谷丙转氨酶（ALT），肾功能检查测肌酐（CRE）。ALT、CRE、TNF-以及淀粉酶的测定均按试剂盒说明进行。 取胰腺、肝脏、肾脏和肺组织各1块。离体组织福尔马林固定，72h后石蜡包埋,常规切片和HE染色，按胰腺、肝脏、肾脏和肺组织的病理学评分标准25得出病理学评分。两组分别取肝脏、肾脏、胰腺、肺脏组织切片1张，以免疫组织化学技术（DBA法）检测TNF-及ICAM-1的表达。 1.3 统计学处理 计量指标结果用均数标准差表示，用SAS软件包行t检验。 2 结果 2.1 大体观察 实验制模10h内无大鼠死亡。制模后10h处死动物时发现普通SAP组大鼠有中等量腹水和大网膜上皂化斑。而病因加重组有大量腹水和大网膜上皂化斑，并且多数大鼠有不同程度的肝脏点状坏死灶和肺脏点状出血灶。 2.2 大鼠血清ALT、CRE、TNF-和淀粉酶 表1列出两组大鼠血清ALT、CRE、TNF-和淀粉酶含量。病因加重组的ALT、CRE、TNF-和淀粉酶含量显著高于普通SAP组。表1 大鼠血清ALT、CRE、淀粉酶和腹水淀粉酶 （略）注：与普通SAP组相比，#P<0.01 2.3 大鼠各脏器病理改变及评分 2.3.1 胰腺组织病理变化及评分 普通SAP组大鼠胰腺组织广泛水肿坏死，脂肪液化坏死，并有散在炎性细胞浸润。病因加重组胰腺组织弥漫的水肿、坏死，脂肪液化坏死，胰腺的正常结构被严重破坏，并有明显炎性细胞浸润。表2为两组大鼠各脏器的病理评分。从中可以看出，病因加重组大鼠的胰腺组织病理评分显著高于普通SAP组。 2.3.2 肝脏组织病理变化及评分 普通SAP组的肝脏组织未见明显病理学改变。病因加重组大鼠可以看到肝脏组织出现多发性的坏死灶伴少量中性粒细胞浸润。从表2可以看出病因加重组大鼠的肝脏组织病理评分显著高于普通SAP组。 2.3.3 肺组织病理变化及评分 普通SAP组大鼠肺泡间质增生、充血，肺泡隔增宽，肺泡腔大小尚均一，有少量炎症细胞浸润。病因加重组大鼠肺泡间质增生出血明显，肺泡腔明显缩小，并有大量炎症细胞浸润。从表2可以看出病因加重组肺组织病理评分显著高于普通SAP组。 2.3.4 肾脏组织病理变化及评分 普通SAP组大鼠的肾脏组织内可见轻微的血管充血。病因加重组的大鼠肾脏切片可以看到肾小管水肿、结构不清，有坏死，并伴有散在的炎症细胞浸润。从表2可以看出病因加重组大鼠的肾脏组织病理评分显著高于普通SAP组。表2 大鼠胰腺、肝脏、肾脏和肺组织病理评分（略） 注：与普通SAP组相比，#P<0.01 2.4 免疫组化检查 2.4.1 各脏器TNF-表达 普通SAP组大鼠的胰腺腺泡细胞胞浆内可见少量TNF-阳性表达，病因加重组大鼠的胰腺腺泡细胞胞浆内TNF-表达呈弥漫阳性；普通SAP组肝脏组织内未见TNF-表达，而病因加重组的坏死灶内TNF-表达呈强阳性；普通SAP组肺泡上皮细胞内见少量TNF-阳性表达，而病因加重组大鼠肺泡上皮细胞内TNF-表达呈强阳性；普通SAP组大鼠肾小管上皮细胞内可见散在阳性表达，而病因加重组大鼠的阳性表达更为明显。 2.4.2 各脏器ICAM-1的表达 普通SAP组大鼠制模后10h胰腺腺泡细胞胞浆内ICAM-1没有明显表达，而病因加重组大鼠胰腺腺泡细胞胞浆内ICAM-1表达呈强阳性；普通SAP组大鼠制模后10h的肝脏组织内可见少量ICAM-1阳性表达，而病因加重组大鼠的肝脏组织内ICAM-1表达呈强阳性；普通SAP组大鼠肺组织内未见ICAM-1表达，而病因加重组肺组织内ICAM-1阳性表达明显；普通SAP组大鼠制模后10h肾脏组织内未见ICAM-1表达，而病因加重组大鼠的肾小管上皮细胞内ICAM-1阳性表达明显。 3 讨论 Gukovskaya等6认为，胰腺炎发病早期胰腺腺泡细胞可产生和释放TNF-，局部组织中被激活的单核巨噬细胞也可产生大量TNF-。急性胰腺炎于发病1h后即可在胰腺及血浆中测到TNF-，并在6h内急剧上升7。TNF-是调节粒细胞激活的重要细胞因子，在SAP病情演变中起重要作用。在导致MODS的全身性炎症反应中，粒细胞的激活处于核心地位。一旦粒细胞过度激活，不但有大量促炎介质过度释放，直接引起过度炎症反应，而且粒细胞自身的吞噬囊泡不能将富含炎症介质的颗粒及时隔离封闭，使中性粒细胞弹力蛋白酶、氧自由基等炎性介质向细胞间质逸出，降解细胞外基质中各种成分，甚至破坏完整细胞；还促使水解多种血浆蛋白，引起凝血和纤溶异常，致使胰腺出血坏死，胰外脏器受损。此外，机体的内稳态丧失，内源性拮抗剂也失去控制促炎细胞因子的能力，从而引发促炎细胞因子连锁反应，使促炎与抗炎细胞因子的含量失去平衡，同时引发网状内皮系统持续激活。此时促炎细胞因子产生了其不利的一面，对机体起损伤作用，导致微循环完整性破坏和远离器官的损伤。 本实验中，病因加重组大鼠血清TNF-含量明显增高，各脏器TNF-和ICAM-1表达均呈强阳性，血清ALT和CRE含量也明显增高，肝、肾和肺等器官的病理形态都有严重损害。这些结果提示，促炎细胞因子（尤其是TNF-）在重症急性胰腺炎早期出现脏器功能障碍的进程中起着关键作用。这就提示我们在病程早期清除或拮抗促炎细胞因子，阻断炎症介质的级联反应，减轻全身性炎症反应，保护器官功能是治疗重症急性胰腺炎的一个重要措施。但是在治疗开始时，由于TNF-和白介素-1所致的广泛效应已经启动，其实际应用价值可能受到限制。然而白细胞的粘附和浸润，均需要ICAM-1的介导，因此ICAM-1的对抗治疗成为近年SAP研究的一个方向。【参考文献】 1 Isenmann R, Rau B, Beger HG. Bacterial infection and extent of necrosis are determinants of organ failure in patients with acute necrotizing pancreatitis. Br J Surg, 1999，86(8): 1020-1024.2 Schmidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg，1992，215(1):44-56.3 Camargo CA, Madden JF, Gao W, et al. Interleukin-6 protects liver against warm ischemia/reperfusion injury and promotes hepatocyte proliferation in the rodent. Hepatology，1997，26(6):1513-1520.4 Thome Uh, Schulze A, Schnabel R, et al. Partial liquid ventilation in severely surfactant-depleted, spontaneously breathing rabbits supported by proportional assist ventilation. Crit Care Med，2001，29(6): 1175-1180.5 Inman SR, Stowe NT, Cressman MD, et al. Lovastatin preserves renal function in experimental diabetes. Am J Med Sci，1999，317(4): 215-221.6 Gukovskaya AS, Gukovsky L, Zaninovic V, et al. Pancreatic acinar cells pr