结肠癌DNA倍体及p27蛋白表达的意义.doc

结肠癌DNA倍体及p27蛋白表达的意义作者：杨文颖 杨志萍 朱永刚 郭玉琳 李千迅 杨卓 闫红岩【摘要】 目的 探讨DNA倍体及p27蛋白表达在结肠肠癌发生发展中的生物学意义。方法 采用免疫组化法对62例正常大肠组织及68例大肠癌组织p27蛋白及DNA倍体的表达及其与临床病理学特征的关系进行分析，并分析p27蛋白表达与DNA倍体的关系。结果 p27在正常结肠组织中的表达率为100%，而在结肠癌组织中的表达率为52.5%，两者有显著性差异(P<0.05)。正常组织中均为DNA二倍体，结肠癌组织中异倍体为66.2。结论 p27蛋白和DNA倍体的不同表达与结肠癌的临床病理学特征密切相关，可能是预测大肠癌预后的重要指标。 【关键词】 p27蛋白；DNA倍体；结直肠癌近年来研究表明，某些癌基因、抑癌基因的表达产物可作为临床诊断或筛选肿瘤的早期指标1。p27基因是近年来发现的一种抑癌基因，其编码的p27蛋白为细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(cyclindependent kinase inhibitor，CDKI)，由于其在细胞周期调控中的枢纽作用，成为细胞分子生物学、肿瘤分子生物学的研究热点，p27基因表达的变化有助于判断肿瘤的预后和指导治疗2。肿瘤细胞的DNA含量与分布异常反映了细胞的分化程度，病理分析能定量或相对定量测定组织、细胞成分多种形态和吸光度特征，并能同时与组织形态观察相结合进行综合分析。本研究应用流式细胞术测定结肠癌、直肠癌患者肿瘤细胞的DNA含量，探讨DNA倍体对结肠癌临床病理学特征的关系，同时应用免疫组织化学SP法对结肠癌组织中p27基因表达及与肿瘤临床病理学特征的关系进行分析，为临床设计合理的治疗方案提供科学依据。1 材料与方法1.1 一般资料随机选取结肠癌手术切除标本68例，年龄3587岁（平均56.5岁）。TNM分期、期48例，、期20例；中、高分化44例，低分化24例；管状腺癌56例，黏液腺癌12例。所有标本均经病理诊断证实。1.2 方法所有标本常规取材，福尔马林固定，石蜡包埋，4 m厚连续切片，用于免疫组织化学染色。1.2.1 p27蛋白的免疫组织化学检测抗p27鼠抗人单克隆抗体、SP试剂盒，DAB显色试剂盒购自福建迈新生化技术开发公司。p27蛋白的检测采用免疫组织化学SP法，以高压枸椽酸盐行抗原修复，DAB显色，胞核、胞浆染为棕色者为阳性细胞。400倍显微镜下每张载玻片计数5个视野，每个视野100个细胞，取阳性细胞数百分比的平均值，<50%为低表达，50%为高表达。1.2.2 DNA倍体的分析采用美国BECKMANCOULTER公司EPICSXL型流式细胞仪，所用DNA倍体分析试剂为Coulter公司成套产品，选用PI荧光染料。所有肿瘤标本放入4生理盐水中，部分常规病理检查，部分进行DNA倍体分析。DNA倍体分析方法：结肠癌手术标本去除脂肪组织及血块，剪成肉糜状，加入生理盐水中，吹散团块呈悬液，180目滤网过滤，再用300目滤膜过滤，8001 000 r/min离心10 min，去上清，加入PBS混匀，在显微镜下计数细胞，使细胞浓度为31053106/ml，再加适量PI染液510 min，上机测定。在直方图上只有单个G0/G1期单峰的为DNA二倍体，而有2个或者2个以上G0/G1期峰的为DNA异倍体(DI指数0.91.1为二倍体，其余为异倍体)，正常S期细胞比率<15%。1.3 统计学处理计数资料行2检验。2 结 果2.1 p27蛋白在结肠癌及正常组织中的表达见表1。结肠癌组织中p27蛋白高表达率为52.5，而正常组织内p27蛋白高表达率为100，正常组织中p27蛋白高表达率明显高于结肠癌组织，两者比较有明显差异（P<0.05）。表1 p27蛋白在结肠癌及正常组织中的表达（略）2.2 DNA倍体在结肠癌及正常组织中的表达见表2。结肠癌组织中异倍体率为66.2，而正常组织内DNA倍体异倍率为0，两者比较有明显差异（P<0.05）。表2 DNA倍体在结肠癌及正常组织中的分析（略）2.3 结肠癌p27蛋白的表达与DNA倍体的关系见表3。结肠癌组织中p27蛋白的高表达率中异倍体率为66.2，而低表达率中异倍体率为90.4，两者比较有明显差异（P<0.05），表明p27蛋白表达降低会导致DNA的多倍体化。表3 结肠癌p27蛋白的表达与DNA倍体的关系(略)3 讨 论 p27蛋白是p27基因的产物，是Polyak等在研究转化生长因子处理的生长抑制细胞及接触生长抑制的细胞株中发现的一种相对分子质量为27 kD的耐热细胞周期抑制蛋白，属kip类，与p21、p57功能相似3。p27蛋白水平低下或缺失可导致细胞过度增殖，引起肿瘤发生。研究发现，p27蛋白主要定位于胞核4，但Surendra等则发现p27蛋白在Barrett食管癌及结肠癌细胞的胞浆和胞核中均有表达，并认为当p27蛋白定位于胞核时其抑制肿瘤的活性明显增高5,6。Catzavelos等7,8发现，p27蛋白在分化不同的乳腺癌、非小细胞肺癌中表达有显著性差异，但在大肠癌中p27蛋白与肿瘤分化关系的报道不一致。本研究显示，高分化大肠癌中p27蛋白高表达比例高，低分化大肠癌中p27蛋白高表达比例低。因此，可以认为p27蛋白影响大肠癌分化途径，促进大肠癌恶性演进。 现今以DNA含量的测定最受重视，应用最为广泛。DNA含量在细胞内所有参数中比较恒定,在细胞周期中随各时相发生周期性变化。根据DNA含量及其分裂复制循环过程大概分为G0/G1期、S期和G2+M期，如果DNA含量发生微小的异常变化就有可能导致恶性肿瘤。近年研究表明，癌细胞DNA定量分析可作为肿瘤患者预后的独立指标9，肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一，随着DNA含量的上升，异倍体或非整倍体的出现率也随之升高。因此，测定细胞核DNA含量与倍体可以了解细胞增殖状态，从而判断细胞有无恶变倾向或恶性程度，其对恶性肿瘤的早期诊断具有重要价值。 综上，本研究认为p27蛋白低表达是促进大肠癌恶性演进的因素；p27蛋白的免疫组化检测结合DNA倍体分析更有助于准确了解大肠癌的生物学行为，为临床工作提供有益的指导。【参考文献】 1 Harris AL.The P53 commonest genetic abnormality in human cancerJ. J Pathology，1990；329:219.2 侯振江，张宗英.p27基因在肿瘤研究中的进展J.国外医学临床生物化学与检验学分册，2005；26(12):960.3 Laken SJ，Petersen GM，Gruber SB，et al.Familial colorectal cancer in Ashkenazim due to a hypermutable tract in APCJ.Nat Genet，1997；17:79.4 Cartwright C.Intestinal cell growth control：role of Src tyrosine kinases (Editorial)J.Gastroenterology，1998；114:1335.5 Kinzler KW，Vogelstein B.Landscaping the cancer terrainJ.Science，1998；280：1036.6 Kressner U，Inganas M，Bycling S，et al.Prognostic value of p53 genetic changes in colorectal cancerJ.J Clin Oncol，1999；17：5939.7 Catzavelos C，Bhattacharya N，Ung YE，et al.Decrease levels of the cellcycle inhibitor P27 protein：prognostic implication in primary breast cancerJ.Nature Med，1997；3:22730.8 Esposito V，Baldi A，de Luca A,et al.Prognostic role of the cyclindependent kinase inhibitor p27 in nonsmall cell lung CancerJ.Cancer Res，1997；57:33815.9 Danesi DT，Spano