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多重耐药大肠埃希菌基因分型及其与耐药表型的关系 作者：李彬， 黄心宏， 傅蔷， 曹颖平， 潘玉红【摘要】 目的 分析福州地区临床分离的多重耐药大肠埃希菌的基因型及其与细菌耐药表型的关系。 方法 收集临床分离的多重耐药大肠埃希菌88株，采用KB法进行药敏试验，多重PCR法进行基因分型。 结果 多重PCR法可将大肠埃希菌分为4个基因型，其中检出D型42株，B2型17株，A型17株，B1型12株。4组基因型对阿米卡星、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和妥布霉素的耐药率差别有统计学意义(P<0.05)。 结论 多重耐药大肠埃希菌对多种抗生素具有很高的耐药性。基因分型以致病性较强的B2型与D型为主，应采取相应措施预防院内感染。 【关键词】 大肠杆菌O157;药物耐受性; 聚合酶链反应;基因型;序列分析 大肠埃希菌是医院感染最常见的革兰阴性条件致病菌，可在医院环境中长期存在，尤其当患者免疫力低下时，常引起泌尿系统、下呼吸道、胃肠道、手术切口及烧伤感染和菌血症，病死率高。近年来医院获得性感染的发病率逐年上升，且由于抗生素的不合理应用和耐药基因的广泛播散，大肠埃希菌对抗生素的耐药问题日益突出，多重耐药临床分离株愈发常见。笔者对临床分离多重耐药大肠埃希菌进行遗传分型，以期获得流行病学资料，便于进一步研究。1 材料与方法1.1 菌株 收集检验科2008年8月-2009年2月临床分离的多重耐药大肠埃希菌共88株，标本来源包括痰、尿液、胆汁、创面分泌物、血液等。多重耐药菌定义为对任何不同三种类型以上抗生素耐药的临床分离株1。1.2 仪器及试剂 常规药敏纸片氨苄西林每片10 g、氨苄西林/舒巴坦每片20 g、阿米卡星每片30 g、环丙沙星每片5 g、左氧氟沙星每片5 g、亚胺培南每片10 g、复方新诺明每片25 g、妥布霉素每片10 g、哌拉西林/他唑巴坦每片100 g/10 g、头孢唑啉每片30 g、头孢呋辛每片30 g、头孢曲松每片30 g、头孢他啶每片30 g、头孢噻肟每片30 g、头孢吡肟每片30 g、头孢噻肟/克拉维酸每片30 g/10 g、头孢他啶/克拉维酸每片30 g/10 g均购自英国Oxid公司;基因分型引物、dNTP Mix(10 mmol/L)、Taq酶、琼脂糖、Loading Buffer(6)、Marker(100600 bp)均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。MH琼脂、伊红美蓝琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司。PCR扩增仪(美国BIORAD公司);全自动细菌鉴定仪(VITEK60型，法国梅里埃公司)。1.3 质量控制 质控菌株为卫生部临检中心的大肠埃希菌ATCC 25922。1.4 方法1.4.1 菌株鉴定 采用全自动细菌鉴定仪鉴定菌株。1.4.2 药敏试验 采用KB法，判断结果参考美国临床和实验室标准协会CLSI标准2。1.4.3 多重PCR 引物参照文献3煮沸法提取细菌DNA作为模板进行扩增。反应体系为总体积20 L，引物各为1 mol/L，dNTP Mix 200 mol/L，Taq酶2.5 U，模板2 L。循环参数为94 5 min94 30 s55 30 s72 30 s，共30个循环，最后1次延伸时间为7 min。引物序列及产物长度见表1。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳后观察结果。表1 多重PCR引物序列1.4.4 基因分型 根据多重PCR扩增产物的电泳结果，按照图1进行分型3：chuA、yjaA和TspE4.C2为多重PCR检测的目标基因; A、B1、B2和D分别表示大肠埃希菌的四个基因型.1.5 统计学处理、采用WHONE T4.0软件分析数据。根据遗传分型结果分为A、B1、B2、D四组，采用行列表资料的2检验对药敏结果的数据进行分析，P<0.05为差别有统计学意义。2 结 果2.1 多重耐药大肠埃希菌耐药谱分析 多重耐药大肠埃希菌除对亚胺培南全部敏感外;对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐药率<14%，可作为除亚胺培南之外的临床经验性用药首选;对其他常用抗生素的耐药率均>60%;其中头孢菌素、氟喹诺酮类耐药率高达80%以上(表2)。表2 多重耐药大肠埃希菌药敏情况2.2 基因分型 采用多重PCR分析88株多重耐药大肠埃希菌，根据PCR产物片段大小结合图1的判读标准进行基因分型得出结果(图2)。本研究中的大肠埃希菌检出D型占总数47.73%(42/88);其次为A和B2型，各占19.32%(17/88);B1型最少，占13.63%(12/88)，说明次实验收集到的多重耐药大肠埃希菌中，大多数存在较强的致病力。2.3 不同基因分型的药敏情况 将88株多重耐药大肠埃希菌以不同基因型分为A、B1、B2、D 4组，并对其对15种抗生素的耐药情况进行统计分析发现，4组对阿米卡星、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和妥布霉素的耐药率差别有统计学意义(P<0.05)。A和B2型对阿米卡星的耐药率为0，较B1和D更为敏感;B2和D型对头孢他啶和头孢曲松的敏感性不如A和B1型;D型对头孢噻肟最为敏感，B2对妥布霉素最敏感(表3)。表3 不同基因分型对药物耐药率比较3 讨 论笔者采用文献3方法对大肠埃希菌进行快速分型。该法快速、高效、准确，可在很短的时间内将大肠埃希菌分为4种主要的亲缘群体，分别是A、B1、B2以及D型。Clermont等在对230株大肠埃希菌进行基因分型时发现该菌主要为B2型，其致病性最强;其次为D型的致病性稍弱;而体内共生的大肠埃希菌主要是A型3。本组多重耐药大肠埃希菌中B2型占19.32%;D型检出比例更高，占47.72%，表明在多重耐药的大肠埃希菌中致病力较强的两种亚型B2和D型共占67.04%，较国内文献报道的73%略低4。Zhang等人报道尿路感染的大肠埃希菌中B型占69%，并推断肠道外感染的大肠埃希菌其约2/3为B2亚型5，与本研究中D型占多数的比例不同，可能是标本组成不同造成差异，也可能是地区差异的缘故，因需进一步研究。研究还发现，A型感染占19.32%，与B2型占的比例相同，由于此型常见于人体内共生菌的亚型3，是否这些临床分离菌属于患者体内共生菌异位感染还有待进一步研究。本组多重耐药临床分离菌株药敏结果显示，其对大部分内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类耐药，而对哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星敏感性较高;其中对亚胺培南的敏感性为100%。尽管亚胺培南对该组细菌具有高敏感性，但因其价格昂贵，临床上并不将其作为治疗的首选用药，因而临床上可选用哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星作为经验性用药。结合基因分型研究与药敏结果分析发现各种基因型药物敏感性存在一些差异，即多重耐药大肠埃希菌的四种基因型虽然对大多数抗生素的耐药情况大致相同，但肠外致病较强的B2型和D型在对三代头孢类抗生素的耐药性均较A型和B1型强。氨基糖苷类抗生素对需氧革兰阴性杆菌具有强大的抗菌活力，但耐药菌株可以通过钝化酶破坏其分子结构造成细菌耐药。本组B2型较其他基因型对阿米卡星的敏感性较好，有待进一步探究。通过根据基因分型结果能明确感染的病原生理学，判断医院感染或是感染复发6;明确不同基因型的亲缘种群与毒力的关系，提示感染致病菌来源。肠道内或肠道外的感染与不同的基因片段相关5，并可作为筛选致病菌的工具，作为感染暴发的筛查和流行病学调查。【参考文献】 1 戴自英. 多重耐药菌感染在临床上的重要意义J. 中华传染病杂志, 1999,17(2);7778.2 Clinical and Laboratory Standads Institute. Performance standards for Antimicrobial susceptibility testing ;18th Informational Supplement S . 2008, M100S18.3 Clermont O,Bonacorsi S,Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic groupJ. Appl Environ Microbiol, 2000,66(10):45554558.4 刘 玲,郑 铃,陈建玲. 福州市饮食行业从业人员肠道大肠埃希菌耐药及产ESBL状况J.福建医科大学学报, 2008,42(1):6569.5 代杰志,陆 茜,蔡成松,等. 大肠埃希菌的分型研究J. 中国微生态学杂志, 2008,20(5):443445.6 Zhang L X,Foxman B,Marrs C. Both urinary and