《蔗糖酶理论讲授》PPT课件.ppt

1,啤酒酵母蔗糖酶 提取、分离纯化、性质鉴定 及反应动力学实验,(必修、综合性大实验),2,正交实验法,正交实验,分子量及 纯度测定,SDS-PAG法,3,一、目的要求,1、熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项； 2、掌握 3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法。,4,二、实验对象,啤酒酵母蔗糖酶 蔗糖酶 (Sucrase，EC.3.2.1.26)又称为转化酶(Invertase)，是催化蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶，广泛存在于动植物和微生物中，主要存在于酵母中。,5,该酶以两种形式存在于酵 母细胞膜的外侧和内侧； 在细胞膜外细胞壁中的称 之为膜外蔗糖酶其活力占总 酶活力的大部分，含有50%糖 成分的糖蛋白； 在细胞膜内侧细胞质中的称之为膜内蔗糖酶 (internal yeast invertase)，含有少量的糖；,6,这两种酶组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，故本实验未区分膜内酶与膜外酶。而且由于膜内酶含量很少，难提取，本实验提取纯化的主要是膜外酶。,两种酶性质和组成对比,7,三、实验步骤及原理,1、蔗糖酶的提取 2、蔗糖酶的纯化 3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定 5、蔗糖酶酶促反应动力学研究,8,1、蔗糖酶的提取 (细胞破壁),9,动物细胞,植物细胞,10,基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。 长5-30m，宽1-5m。,11,生物材料破碎的方法,（1）机械（匀浆）法 （2）超声波处理法 （3）反复冻融法 （4）化学处理法 （5）溶胞作用 (酶溶解法) （6）自溶法,12,（1） 机械（匀浆）法 研钵,The Nobel Prize in Chemistry 1907,Eduard Buchner爱德华比希纳(18601917) German organic chemist and biochemist,13,Teflon：聚四氟乙烯,先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。,（1）机械（匀浆）法 玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）,14,（1）机械（匀浆）法 高速组织捣碎机（0.5-1L）、,将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。,均质机,高速组织捣碎机,15,（1）机械（匀浆）法 高压匀质机（XL）,高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。,优点：快速 ，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上,高压匀质机,16,（2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常选用浓度为 50-100 mg/ml菌体，在 30 至 60Hz 频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。,水浴式 探头式,17,（3）反复冻融法： 将细胞在 -20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法： 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠 (SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。,18,（5）溶胞作用 (酶溶解法)： 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 （6）自溶法： 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。,19,自溶法破壁（本实验）,干酵母粉,溶于蒸馏水,乙酸钠,乙酸乙酯,35恒温,搅拌40分钟,35恒温过夜,补加蒸馏水,搅拌均匀，成糊状,离心,弃沉淀及脂层,E1,记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜）,超声波破碎：使用超声波破碎仪在 50% 的功率 (约 450W 左右)，超声 20min (40min), 超 5s 停 5s，6 探头。(冰浴),20,2、蔗糖酶的纯化,21,1. 酶的蛋白属性； 2. 调节酶溶解度的方法； 有机溶剂分级沉淀 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 透析、凝胶层析 4. 根据酶分子电荷性质的分离方法； 离子交换层析 5. 根据酶分子专一性结合的方法;,酶的纯化方法,22,1. 酶的蛋白属性 两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 等电点 (isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。,23,大分子(胶体) 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达 1100nm，为胶粒范围之内。 稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜,24,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,25,2. 调节酶溶解度的方法；,（1）改变离子强度； 盐析 硫酸铵分级沉淀 （反抽提法）,反抽提法（Back Extraction） 例：E.coli RNA聚合酶 42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀 通常方法：先 33%-再 50% 反抽提法：再 42%,将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。 蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特异性,26,（2）改变pH或温度； 酶在未纯化之前 PI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD的纯化可在 70 oC，10 min （3）改变介电常数； 有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。,27,有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。 温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。 样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好。,28,3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法；,（1）透析、超滤；,利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物质的扩散运动，将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法.,用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。 用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩。,29,（2）透析、超滤；,30,中空纤维超滤装置,多层平板小型实验室超滤装置,小型盒式平板超滤UF系统,小型实验室超滤装置,31,（3）凝胶层析 （gel chromatography）,凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 凝胶层析 常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。,32,凝胶过滤层析的原理.MPG,凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。,33,34,凝胶层析的应用范围：,凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。,凝胶层析的优点： 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。,35,凝胶层析的特点,凝胶层析操作简便，所需设备简单； 分离效果较好，重复性高。 最突出的是样品回收率高，接近100； 分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键 的变化，所以对分离物的活性没有不良影响； 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、 多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。 分离的分子量范围很宽，如 Sephadex G类为 102105D；Sepharose类为105108D。,36,装柱.MPG将玻璃柱固定垂直，装入脱气的蒸馏水（约为柱体积 的 1/3），以避免胶粒直接冲击柱底支持物。固定玻璃 柱，调整垂直； 装凝胶：边搅拌凝胶，边向柱内缓慢、连续、均匀地装入 凝胶（打开柱底端的螺旋夹）不要中断，使胶粒均匀沉 降，以免胶面倾斜和发生断层； 检查：用眼观察有无凝胶分层、沟流和气泡现象； 柱平衡：用脱气蒸馏水平衡凝胶柱，用出口处的螺旋夹将流 速控制在1ml/min（用量筒和秒表测定）,Sephadex-G75 凝胶层析（本实验）,37,上样：将柱中的5mmol/L pH6.0缓冲液逐渐放出，当液面 接近柱床表面时，用长吸管沿柱壁绕环小心加入E3，上 样量控制在柱体积的2%-5% （不要冲坏柱床表面）；打 开凝胶柱出口处的阀门，使样品缓慢、均匀地进入柱床， 然后用少量缓冲液清洗柱的内壁，并将清洗液也流入凝胶 柱，关闭凝胶柱出口处的阀门。 洗脱：在凝胶上面缓慢加入缓冲液，连接恒压洗脱瓶， 开始洗脱。 收集：根据记录仪上的蛋白峰手工收集（或者用部分收集 器收集），收集峰尖处的酶样品，用 PEG6000 浓缩后， 用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。,38,4. 根据酶分子电荷性质的分离方法；,离子交换层析 基本原理 ： 以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。,39,Equilibration,离子交换分离的基本步骤-平衡-上样-吸附-洗脱-再生,40,离子交换分离的基本步骤-平衡-上样-吸附-洗脱-再生,41,Elution,离子交换分离的基本步骤-平衡-上样-吸附-洗脱-再生,42,Regeneration,离子交换分离的基本步骤-平衡-上样-吸附-洗脱-再生,43,Sample application and wash,Elution,Equilibration,Regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,44,如何选择离子交换介质,对pI=5的某酸性蛋白质， 当蛋白质为阴离子时，在 pH5.5-9.0 的范围内应选阴离子交换剂； 当蛋白质为阳离子时，在 pH3.5-4.5 的范围内应首选阳离子交换剂,45,平衡离子 决定树脂正负,在介质中带正电的物质用阳离子交换剂；带负电物质用阴离子交换剂。,46,阳离子交换树脂： 强酸性树脂：主要是磺酸型树脂，功能基团为磺酸根及甲基磺酸根； 中酸性树脂：主要是磷酸型树脂，功能基团为磷酸根； 弱酸性树脂：主要是羧酸型树脂和酚型树脂，功能基分别为羧基和酚基。,离子交换树脂,47,阴离子交换树脂 强碱性树脂：功能基团多为季胺-N+R3； 有两种强碱性阴离子交换树脂，一种含三甲胺基称为纺 织品碱型，另一种含二甲基-羟基-乙胺基团，称为 强碱型。 中强碱性树脂：兼有以上两类活性基团。 弱碱性树脂：弱碱性阴离子交换树脂的活性基团是伯、 仲、叔胺基，即-NH2，-NHR，-NR2，吡啶基等。,48,树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类； 特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高；,离子交换纤维素,49,适量水浸泡，漂洗，使之充分溶涨； 数十倍的0.5mol/L氢氧化钠液反复浸泡0.51h，每次换液皆须用水洗至近中性； 按交换的需要用平衡离子处理； 最后以交换用缓冲液平衡备用。,离子交换纤维素的预处理,50,装柱：本实验使用DEAE-52离子交换树脂，先把柱内装1/3的5mmol/L pH6.0磷酸起始缓冲液，把柱子垂直固定；将DEAE-52离子交换树脂用起始缓冲液调稀、搅匀后加入，柱内的DEAE-52离子交换树脂应非常均匀地分布，防止出现截面和气泡，床面要平整，床高约1.5cm为宜。用起始缓冲液洗柱，控制好流速（防止流干）； 平衡：用5mmol/L pH6.0 的磷酸起始缓冲液平衡过夜。 上样：将储液瓶中的缓冲液放尽，封闭出口，将E2 加入到储液瓶中，连接出口与离子交换柱的进液管道，打开截流阀，注意控制流速，使流出液的流出速度为1.5ml/min左右。,DEAE-52 离子交换层析（本实验）,51,洗柱：样品全部进入床面后，在柱面加入2cm的缓冲液，在储液瓶中加入5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液，连接紫外检测器、记录仪和收集器，打开截流阀，洗出未吸附的杂蛋白。目测记录仪上的紫外吸收峰的酶活力，检查流出液中是否有酶活力存在（即酶是否挂在离子交换树脂上）。洗柱体积控制在5个柱体积左右。 目测酶活力方法：取两支试管，各加入1ml 5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始缓冲液，另一支中加1ml洗柱流出液，同时于35恒温水浴中进行水解反应3min，然后各加DNS 试剂1ml ，于沸水浴中反应5min ，比较两支试管颜色的深浅。,52,洗脱：本实验用阶段洗脱进行。用含 0.15mol/L NaCl的5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液100ml，控制流速为1.5ml/min，用小试管收集。收集酶活力峰：目测记录仪上的蛋白峰的酶活力，确定酶活力峰的位置。 用试管收集峰尖处的样品3ml，浓缩后用于凝胶层析；合并其它剩余酶活力峰得到E3，量出总体积V3（留2ml置于冰箱中保存，待测酶活力及蛋白质浓度），其它酶液于4过夜透析，留动力学实验使用。,53,3、蔗糖酶的活性测定,54,酶活力 (enzyme activity) 酶催化某一反应的能力V,V单位时间内单位体积中 底物 (substrate) 的减少量或 产物 (product) 的增加量,55,条 件：,1、催化反应总的反应式； 2、酶是否需要某种辅助因子(cofactors)； 3、酶最适时的pH和温度。,哺乳动物的酶，最适温度通常在25 37。,56,1、测定酶活力时应注意几点,（1）应测反应初速度 (initial velocity or initial speed) (如每分钟底物转换的mol) （2）酶速度 (velocity)：酶催化反应的速率，符号V0 :molmin，以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的斜率即等于V0。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使 SE。,起始期产物迅速形成(线性部分) 速率下降底物用尽和或酶失活,57,国际单位（IU）：在特定的条件下，每分钟催化1mol 底物转化为产物所需的酶量。 催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转 化为产物所需的酶量。,1 IU= 16.6710-9 kat,酶活力单位：,2、酶活力和比活力表示方式,58,活力 (或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数 (U/mg蛋白)。在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。,酶的比活力 (specific activity，也称比活性）,比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml） 比活力有时也可用每g或每ml 酶含多少个活力单位来表示,59,最方便的测定：测量产物出现的速率或底物的消失速率,3、 酶活力的测定方法, Light absorption,1、底物(或产物)在特殊波长下吸收光,60,DNS 法测定蔗糖酶活力（本实验）,1、 3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理：,2） 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。,1）,2、 蔗糖酶活力测定的原理： 1）蔗糖酶催化的反应是： 2）蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。,蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖,蔗糖酶,61,3、 DNS比色定糖法工作曲线的制作： 取8支血糖管编号1-8，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（2mg/ml）、蒸馏水、3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大烧杯代替沸水浴锅），取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的吸光度值。 以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出工作曲线。,62,3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作,63,蔗糖酶活力的测定： 操作： 取两支试管分别加入用 pH4.6, 0.2mol/L 的醋酸缓冲液适当稀释过的酶液 2ml，一支中加入 0.5ml 1mol/L的 NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管；把两支试管和 5% 的蔗糖溶液放入 35 水浴中预热恒温；分别取 2ml 5% 的蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时间，3 分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L 的 NaOH，摇匀，终止反应。 从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。 在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力： E = 葡萄糖mg数(4.5/0.5)E的稀释倍数/2ml,64,4、蔗糖酶的蛋白浓度测定,65,紫 外 吸 收 法,双 缩 脲 法,Folin-酚法 (Lowry法),66,67,68,这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为实验室所采用，也是文献上用得最多的方法之一。,Folin-酚法 (Lowry法),(A) 凡含有两个及两个以上肽键 (-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中 (如 Folin-甲试剂) 都能与 Cu2+ 作用，形成紫色的复合物； (B) 所有的蛋白质均可与 Folin-甲试剂反应形成紫色的铜-蛋白质复合物； (C) 铜-蛋白质复合物在 pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸 (Folin-乙 试剂) 还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅 (在一定范围内) 与蛋白质的含量成正比。,干扰物质与双缩脲法相同，而且受它们的影响更大。 （附2）,原理:,69,三种蛋白质测定方法比较,70,71,72,制作工作曲线的注意事项 1.分光光度计的使用： 测样时，光吸收值A应在0.100-0.700之间，并小于标准曲 线的最大值，否则，缩小或加大样品的稀释倍数，重测！,73,2. 比色杯的使用： 1). 洗净（洗净的标准是：透明、无痕迹、不挂水珠）后，置小烧杯内 用蒸馏水浸没； 2). 用蒸馏水or buffer校正（方法在仪器室讲），然后在杯底标上记号 （0、1、2、3）； 3). 向杯中加样液时，按浓度从低到高的顺序加，注意加样到比色杯的 2/3处；如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许搽）；再用镜头纸 向一个方向搽至透明； 4). 将装有参比、样品溶液的比色杯放入比色杯架上时，要摆放在一条 直线上； 5). 倒出液体后，一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置在滤纸上吸干； 6). 任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上； 7). 各台分光光度计的比色杯是配套的，不许随意调换使用。,74,3.工作曲线的制作： 1）反应： 取液量准确：移液管洗净、标号、润洗，最好同一人取样； 温度准确：（恒温水浴中放有温度计），记时准确（用秒表）； 所用的标准液、buffer、反应液应是同一批配制的； 加入Folin-乙试剂时要特别小心！因为Folin-乙试剂只有在酸性条件下稳定，而反应是在碱性溶液中进行，所以加入Folin-乙试剂后，一定要迅速摇匀（加一管摇一管）； 2）测量： 由同一个人读数； 制作标准曲线及测量样品使用同一台仪器； 3）记录： 实验记录要清晰，实验结束后要请教师签字； 记录仪器使用情况。 4）制图： 标明：曲线名称、横纵坐标的单位、仪器号、使用时间； 注意实验点的分布、大小（依据误差）、直线的角度（最 好在45度左右） 不许延长工作曲线（比耳定律适用于稀溶液中的反应）。,75,结果及数据处理,1.原始数据,2.洗脱曲线：,76,3.数据处理（有关计算 ） 1）E = 葡萄糖mg数（4.5/0.5）E的的稀释倍数/2ml =（ ）U/ml 2）总活力：EV 3）Pr：查标准曲线 4）总Pr量：PrV 5）比活力：E/Pr or 总活力/总Pr量 6）阶段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力 7）总收率：E3总活力/E1总活力 8）提纯倍数：比活力n/比活力n-1，n=1，2，3 将计算出的数据添表：表格见后,77,蔗糖酶酶样品,酶浓度,总活力,蛋白浓度,总蛋白量,比活力,提纯倍数,阶段收率,总收率,（ml）（u/ml）（u）（mg/ml）（mg）（u/mg） （%） （%）,样品体积,E1 E2 E3 E4,78,酶的提纯过程记录格式 （设想的提纯步骤）,79,80,5、蔗糖酶酶促反应动力学研究,81,酶促反应动力学？ (Kinetics of enzyme-catalyzed reaction ) 酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。,82,1、影响酶促反应速度的因素 pH值 温度 酶浓度 底物浓度 激活剂 抑制剂,83,pH对酶反应速度的影响,在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性, 通常称此pH 为最适pH。,84,温度对酶反应速度的影响,一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下，反应速度最大,85,酶浓度对酶反应速度的影响,如果底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。,86,底物浓度对酶反应速度的影响,在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,87,2、酶促反应动力学方程式米氏学说,S： 底物浓度 m： 米氏常数 Vmax：最大反应速度 V： 不同S时的反应速度,Michaelis L and Menten ML.,. Biochem Z. 1913, 49: 333369.,88,米氏常数（Km）的意义,Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。 Km值作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度条件而言，测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。 1/ Km可以表示酶对底物亲和力的大小, 1/ Km越大, 表明亲和力越大, 多底物酶有不同的 Km值, 最适底物的Km值最小。,89,当V=Vmax/2 时，米氏方程变换为：,V = 1/2 Vmax, Km = S 米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 米氏常数的单位为mol/L。,90,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,双倒数作图法：、 将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：,Km和Vm的测定,91,以1/V对1/S作图得一直线，其斜率是Km/Vm，在纵轴上的截距为1/Vm,横轴上的截距为-1/Km。,92,5、蔗糖酶米氏常数的测定（本实验） 1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按07编号，0为对照管。 3）按下表将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。 4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。 5）于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在35水浴中准确反应3min。 6）按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。 7）吸取反应混合物0.5ml，加入盛有3ml DNS试剂和1.5ml去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定A540值,93,94,数据处理： 以