十字花科植物远缘杂交障碍研究.docx

十字花科植物远缘杂交障碍研究摘要：本文对十字花科远缘杂交障碍的表现进行研究，并结合这些研究阐述杂交不亲和的克服方法。 关键词：十字花科；远缘杂交 植物的远缘杂交是指种以上分类单位间的杂交，以属间和种间杂交最为常见。随着育种工作的深入发展，作物种内的遗传资源日益枯竭，利用其近缘有益资源，拓宽遗传范围，日益受到了育种工作者的广泛关注。导入有益遗传资源的方法主要有个体水平上的远缘杂交、细胞水平上的原生质体融合及分子水平上的基因工程。远缘杂交是一条传统且有效的途径，除改良物种外，远缘杂交还可以创造新物种，Kwan (1992)提出非整倍体育种的概念，赋予了远缘杂交手段在创新物种领域新的意义。 1 远缘杂交障碍的表现 尽管远缘杂交育种在转育有利基因、创造新的遗传类型上取得了很大成绩，但由于远缘亲本间遗传关系相对较远，在有性杂交过程中会出现各种障碍，主要表现为杂交不亲和、杂种夭亡、杂种不稔及杂种后代疯狂分离。 1.1 花期不遇 不同生育期特别是花期相差很大的物种间的杂交十分困难。据张国庆等(2000)试验，甘蓝(苏晨一号)白菜型油菜(BAUMI90，CANA ECHO)，由于甘蓝的冬性极强，无法开花或开花延迟,使杂交无法进行。 1.2 杂交不亲和 植物受精是一个复杂的生理生化过程。远缘杂交不亲和是指2个可育属种授粉后其杂交的障碍发生在受精之前。这种不亲和是由于亲本间遗传物质的差异和生理机制上的不协调所造成的，是物种间存在生殖隔离和遗传差异的直接反映。Takamine(1916)发现基本种白菜型油菜的染色体数2n=20,Karpechenko(1922)则首次报道芸苔属另外两个基本种黑芥和甘蓝的染色体数分别为2n=16和2n=18.后来Karpechenko(1929)研究证试芥菜型油菜和挨塞俄比亚芥两个复合种的染色体数分别为2n=34和2n=36。根据细胞遗传研究结果Morinaga将白菜型油菜染色体定为A染色体组，黑芥染色体定为B染色体组，甘蓝定为C染色体组。李俊（2006）对人工合成的甘蓝型油菜减数分裂行为观察结果表明，A C2组在甘蓝型油菜细胞内保持独立，在减数分裂前期I表现分裂速度存在差异，在后期I，末期I以及第二次减数分裂过程中很少出现染色体的异常配对现象。而人工合成油菜最初几代的染色体结构变化可能更多的来源于基因组内部的易位和重组。祝朋芳用大白菜胞质雄性不育系（Ar）与羽衣甘蓝品种(Y3)杂交,对种间杂种花粉母细胞（PMCs）减数分裂观察表明源于大白菜的A组染色体和源于羽衣甘蓝的B组染色体间同源性较高，仅存在两条染色体不能配对。 程雨贵（2005）对萝卜和甘蓝的杂交后代进行细胞学鉴定。结果表明两类植株的子房体细胞染色体数目均为18条，但减数分裂染色体行为不一致。偏母植株染色体能正常配对、分离，终变期形成9个二价体，后期I染色体9/9均衡分离，说明这些单株不是萝卜和甘蓝配子的受精后代。中间型植株的减数分裂不规则，终变期出现多个单价体和少量二价体;后期I染色体分离不规则，证试这些单株是预期的萝卜和甘蓝属间杂种。吴沿友(1995)发现萝卜和白菜杂种F1，幼茎体细胞染色体数目是19，但花有大小两种，小花不结籽，其PMCs为未加倍类型，2n=19;大花能结籽，其PMCs为加倍或部分加倍类型。部分加倍PMCs形成不平衡的三分体10-10-9，他认为这是一种染色体组分割(染色体组分开)现象。以上学者的研究表明，由于芸薹属间染色体组数以及同源性比较复杂，所以在属间种内杂交时往往产生亲和性的障碍。 远缘杂交中也发现染色体组分开现象。李再云研究发现，十字花科芸苔属栽培种与诸葛菜的属间杂种在细胞分裂过程中，亲本染色体组发生完全与部分分开，即在杂种细胞有丝分裂及减数分裂的过程中，来自两个亲本种的染色体组在细胞内分开排列，并分别向细胞两极运动，最后被包含在两个子细胞中，形成具两个亲本种染色体的单倍体细胞，经染色体复制后便形成两亲本的二倍体细胞。亲本染色体组的部分分开则会形成附加或互换另一亲本部分染色体的细胞，经过进一步的分裂就会产生具有易位染色体的细胞(李再云，2002 ) 。 十字花科作物属种间杂交时存在着明显的不亲和现象。孟金陵(1987)在荧光显微镜下发现甘蓝型油菜和甘蓝不亲和的重要因素之一是甘蓝花粉在甘蓝型油菜柱头上的萌发受到严重抑制，萌发的花粉粒明显地少于对照甘蓝型油菜弱自交不亲和品种华油3号的自交结果。瞿波(1996)用甘蓝型油菜的花粉授以诸葛菜时，也发现多数花粉不能萌发。此外，萌发的花粉管受阻于异种乳突细胞而产生胼脂质沉淀是受精前障碍的另一显著共性(孟金陵，1987；瞿波等，1996；王幼平等，1997；吴俊等，1999)。 芸薹属植物远缘杂交普遍存在着受精前障碍，主要表现在花粉与柱头的不亲和性上 。芸薹属植物属于干燥型柱头，柱头突起较长，表面缺少或只有少量液态分泌物。花粉在乳突细胞表面发生水合作用而粘在柱头上后，花粉萌发，花粉管进人柱头，伸人花柱。穿过珠孔，受精。此过程中的不亲和性都可能导致受精失败。远缘杂交授粉后。柱头乳突细胞内沉积的大量胼胝质是远缘杂交时柱头对异缘花粉的一种特异性拒绝反应，其反应程度与杂交亲本的亲缘程度有关。湖北诸葛菜O hupehensls与甘蓝型油菜AD一2杂交，发现湖北诸葛菜花粉粘合在油菜柱头表面的花粉较多，但花粉萌发较迟，柱头乳突细胞有强的胼胝质反应，未见花粉管伸入花柱。研究认为，决定自交不亲和的S基因在种问杂交亲和性中也起着一定的作用，这种作用主要表现在雌蕊方面有的研究也认为，两类不亲和反应是由作用机制类似但相互独立的两套遗传体系控制的，并且母本型对这种受精不亲和反应的强弱有明显的影响，远缘杂交应以遗传基础丰富的杂种一代为母本。刘忠松认为，杂交亲本、杂交组合方式和生态环境也影响了杂交的亲和性。 1.3 杂种天亡 受精后的胚胎发育障碍普遍存在于芸薹属植物种问杂交中。Hakasson详细地报告了在二倍体水平上和同源四倍体水平上进行的白菜型油菜与羽衣甘蓝正反杂交的胚胎学观察结果。研究认为，胚和胚乳有极敏感的发育上的平衡关系。正常发育中的胚是由胚乳提供营养的，没有胚乳或胚乳发育不充分，幼胚发育就中途停止或解体。徐爱遐等试验表明，由于胚乳在发育的过程中解体，胚得不到发育所需的营养而停止发育。胚乳提前解体可能与子粒内a一淀粉酶的活性有关。胡金良等研究观察结果 认为，胚珠败育也是导致远缘杂交失败的一个原因。对于造成远缘杂交受精胚珠内胚和胚乳败育的内在原因目前尚不清楚，一般认为是胚、胚乳和子房组织间缺乏协调性，具体有以下几个方面：一是胚产生了某种物质抑制胚乳的生长；二是胚乳发育不正常，导致胚败育；三是营养分配不合理，胚珠被垄断了营养物质，而胚和胚乳没有得到应有的营养；四是杂种胚缺少某些化学物质或它们的浓度改变引起幼胚的死亡。潘大仁研究指出，减数分裂期遗传障碍是属种间不育的主要原因之一。 杂种夭亡是指花粉能够在异属种柱头上萌发并完成受精，而在胚胎发育过程出现障碍。如胚乳过早解体而使胚体发育过程中因不能得到充足的营养而夭亡；或杂种胚体发育完整，但不能正常萌芽或仅形成弱小畸形幼苗，苗期夭亡。邱德勃等(1986)发现萝卜和甘蓝属间杂种胚乳细胞内质网发育畸形，胚乳细胞提前形成，导致胚乳解体提前。在胚乳很早发生衰败的胚囊中，胚从2细胞期甚至更早的合子期开始败育；在较晚衰败的胚囊中，杂种胚曾存活较长时间，但胚各部分生长失调。吴江生等(1992)发现甘蓝型油菜和芥菜型油菜(B.ju ncea)的受精胚珠中，只有约1/10能够发育成熟或近成熟。王幼平(1997)在芸薹属三种油菜与海甘蓝杂交中也发现杂种胚出现异常情况。目前认为杂种胚的败育是主要由于胚和胚乳细胞之间的不协调造成的。 思想汇报 1.4 杂种不稔 远缘杂种不稔主要表现为杂种后代虽然生长正常，但由于双亲基因组之间、细胞核与细胞质之间不协调而使杂种后代不能正常生殖的现象。杂种不稔并不止于杂种一代，甚至可以持续几代。远缘杂种不稔机理比较复杂，染色体在减数分裂过程中的异常增减或配对、核质关系不协调是杂种不稔的主要原因。此外，外界环境对杂种减数分裂及配子形成也会产生影响而造成不稔。事试上，亲本型配子竞争能力的大小可能是远缘杂种F1稔性的根本原因(卢长明等，1999；徐书法，2003)。 2 克服远缘杂交障碍的方法 2.1 促使花期相遇 在进行远缘杂交时，亲本花期不遇的问题，可以分情况采取以下措施来解决：当两亲花期差距不是很大时，可将早熟亲本延迟播种或分期播种，达到与迟熟亲本花期相遇。当两亲花期差距较大时，若晚熟亲本为长日性植物时，可给予其必要的光照补充；反之，若晚熟亲本为短日植物时，可限制日长对其进行遮光处理。在有条件的情况下，可在温室里调节花期相遇。在进行冬、春性植物杂交时，可对冬性极强的亲本进行春化处理，使其完成春化阶段后，再与春性亲本同时或先后播种于温室，调节光照，促使两亲花期相遇。对于生长过快的亲本，可以采取打顶、去蘖和控制水肥等措施，以推迟花期，使两亲花期相遇。 2.2 杂交不亲和的克服 2.2.1 改良授粉方法 蕾期授粉 目前普遍认为不亲和性反应的因素一般是仅在刚开花之前出现，在雌蕊早期，柱头上起识别作用的蛋白质尚未合成，抑制因素尚未出现，此时用成熟花粉授粉，可以躲过花粉一雌蕊之间的识别反应而使授粉成功。孟金陵(1987)在研究花粉一雌蕊相互作用时发现，未成熟雌蕊的亲和性相对较大。曹必好等(2000)发现这与克服自交不亲和的原理有些相似。吴俊等(1999)在用甘蓝型油菜和诸葛菜杂交花期授粉时柱头上附着花粉和萌发的花粉都较少，未见到花粉管伸入花柱，而在花前2-5天的蕾期授粉时则见到花粉附着量大，萌发多，且有花粉管伸入花柱。 重复授粉 用远缘花粉给雌蕊多次授粉，目的是使柱头上的识别蛋白逐渐消耗掉，而使异缘花粉萌发。此外，对于已形成识别蛋白的柱头，可以用有机溶剂、机械损伤、热处理等方法处理柱头表膜。 2.2.2 体细胞融合 体细胞融合避开了有性交配过程，因此不存在受精不亲和的问题。近年来，在高等植物上，体细胞杂交已有相当进展。在有性杂交不能进行时，可采用体细胞杂交获得种、属间杂种。1980年拟南芥菜(AR)与白菜型油菜体细胞杂交成功，获得了属间杂种植株。1982年，通过甘蓝与白菜的原生质体融合，人工合成了甘蓝型油菜。体细胞融合为从亲缘关系较远或受精亲和性极低的杂交组合中获得新材料、新品种开辟了一条新途径。 2.3 杂种天亡的克服 试践证明，在幼胚发育的适宜时期取出人工离体培养，可以克服杂种胚因营养馈乏造成的夭亡。自西贞夫(1959)最早采用离体胚培养的方法克服甘蓝和白菜杂种胚败育成功获得5株杂种幼苗以来，离体组织培养法己被广泛用于克服十字花科属种间远缘杂交的不亲和(李明山等，1992；梁红等，1994；吴沿有等，1996；文雁成，1999；殷家明等，1998；张晓伟，2001；祝朋芳等，2003)。 2.4 杂种不稔的克服 2.4.1 染色体加倍 采用染色体加倍法使远缘杂种后代育性恢复的试例在其他植物上已有成功报道，如邱园报春(Primula kewensis,2n =36,AA BB)是多花报春(P.polyantha,2n =18,AA )和轮花报春(P.vulgaris,2n =18,BB )的种间杂种经染色体加倍后形成的远缘杂种。染色体加倍法适用于各染色体组处于单倍状态的杂种处理，但这样合成的双二倍体由于各亲本来源的染色体在复制、分离、移动上均存在差异，二倍体化机制不稳定，育性可能依然不理想，需进一步回交或选择提高育性。 2.4.2 回交 回交法主要用于克服染色体组不平衡或核质不协调引起的杂种不育。远缘杂种F1与亲本之一回交有望提高育性。回交次数可依据回交后代育性恢复程度和试验目的来确定。徐书法(2003)在大白菜与芥菜、甘蓝型油菜种间杂交研究中，随着回交代数的增加，杂种后代的结试性得到了显著提高。但有学者认为，与亲本回交后可能还不如原始亲本杂交亲和性强(Ayotte