都匀白及的组织培养与植株再生研究.docx

都匀白及的组织培养与植株再生研究 摘 要：近年来由于都匀本地野生白及被大量采挖，数量越来越少。因此，建立白及人工繁殖的方法，通过组织培养建立白及植株再生体系，实现都匀本地中药产业现代化大量种苗的需求。本次实验通过植物组织培养技术，对白及进行培养获得再生苗，然后进行增殖培养，在不同的培养基上人工快速繁殖，以寻找都匀白及无性快繁体系的培养条件。结果表明：最佳丛芽增殖培养基为：1/2MS+6-BA 3ml/L+KT 1ml/L+2，4-D 1ml/L；最佳丛芽的生根培养基为：1/2MS+6-BA 2ml/L+KT 1.5ml/L+ NAA 1ml/L。 关键词：白及；中药材；组织培养；无性快繁；都匀 白及（Bletilla striata Rchb.f.）?倮伎疲?Orchidaceae）白及属（Bletilla Rchb.f.）多年生草本植物。花的颜色主要有紫色、白色、黄色、红色和蓝色等，形奇特，可作盆景观赏。白及别名白及、干根、连及草。药用部分在中药里又称良姜、紫兰。李时珍在本草纲目中解释其名为：其根白色，连及而生，故曰白及。白及一般生长在灌木丛下、草坡或路旁湿润处。主要分布于云南、陕西、四川、湖北、甘肃等省份，全国各地有少量栽培。扁球形的假鳞茎，表面有环形纹带，富有粘性。白及常以其块茎根入药，具有补肺，收敛止血，消肿生肌等功效4-5。近年来，随着对白及的研究开发利用的不断深入，白及不仅具有广泛的药用价值和园林价值外，也广泛用于生产日用百货，例如化妆品、高级陶瓷制造、纺织、橡胶等都需要白及的参与。因为白及的利用价值，市场对白及的需求量也渐渐增大，野生资源急剧减少。白及种子十分微小，在自然条件下繁殖效率低，成本高。所以采用组织培养繁殖十分有必要8-10。 白及的常规组织培养繁殖多为利用无菌播种，然后直接长大成苗的技术路线。从优良单株为起点，保证基因一致性。通过此方法可实现全年均衡生产，更灵活地满足市场需求，缩短生产周期，降低成本，从而加快推进白及中药产业现代化进程。 本实验采用植物组织培养技术，对分布于贵州省都匀市地区的野生白及进行培养，建立无性快繁体系，为产业化生产大量种苗奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 白及（Bletilla striata Rchb.f.）于2015年9月采自都匀市绿茵湖社区高坡，凭证标本存黔南民族师范学院植物标本馆。 1.2 方法 1.2.1消毒灭菌 假鳞茎先用75%酒精浸泡5-10s，立即用无菌水冲洗10次左右。后用0.1% HgCl2消毒5 min，立刻用无菌水漂洗3-8次，将消毒好的外殖体接种在已灭菌好的培养基上，移到培养室进行培养。 1.2.2培养基与培养条件 苗培养基：以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，添加相关激素：6-苄氨基嘌呤（6BA）、激动素（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）。应用正交表L16（4）4设计不同因素水平配比的培养基配方；pH值5.8-6.4为宜。 在超净台工作台中将进行灭菌处理好的白及外植体接入相应的培养基中，置于温度（203），光照强度1500lx，光照时间为10h/d的条件下进行培养。 1.2.3诱导和继代培养 将灭菌处理好的外殖体接种到设计好的培养基上，每7 d观察1次，并做好相关各项记录。 1.2.4白及的生根培养 将培养后的丛生芽分成单株，接种在生根培养基上，每7 d观察1次，并作相应记录。 2 结果与分析 本次实验通过正交设计，可得16个处理梯度。每个梯度做1L的培养基，平均分装在35个培养瓶中，每个培养瓶接种10个丛芽数，1周后观察并统计结果。 2.1 丛芽的增殖培养 由于此次实验是在利用都匀白及的种子培养后的种苗为基础进行增殖和生根培养，所以利用正交设计后，进行个梯度的培养，在实验过程中，各个梯度都有增殖芽发生，但是统计下来，1/2MS+6-BA3ml/L+KT1ml/L+2，4-D1ml/L培养基培养出来的增殖芽数最多，而且芽长势优良，粗壮茂盛，叶嫩绿发亮。其余的培养基的苗多少出现不同程度的问题。因此决定采用1/2MS+6-BA3ml/L+KT1ml/L+2，4-D1ml/L为增殖培养基进行后续的增殖培养，并且得到了大量的优质组培苗。 2.2 丛芽的生根培养 在正交设计实验过程中，同时也得到了苗的生根培养基。在本次试验过程中，由于出现了有苗在5d后长根的现象，而且有根长势正常，粗壮，长，不定根多的情况，因此在芽的生根培养时，直接采用这里面生根最多最好的培养基进行生根培养，即1/2MS+6-BA2ml/L+KT1.5ml/L+NAA1ml/L。 3 讨论 都匀白及在自然状态中繁殖，或者在人们原生态的传统种植方法下，白及的繁衍增殖几率比较低，原本市场对白及的需求量就较大，于是会出现白及市场供不应求的情况。本实验采用白及无性快繁的方式，缩短都匀白及的繁殖周期，在一定程度上满足市场需求。在借鉴前人对白及快繁的研究成果时，发现前辈们都会在培养过程中除了加入相关的植物激素外，还在不同程度上加入香蕉泥、椰子汁和土豆泥等辅助成分。然而在本次试验中，仅仅只是在基本培养基中加入一定量的相关激素，同样可得到显著的效果。这样操作简便，既节省精力又节约资本的方法，可在今后对都匀白及的工业化生产中大力推广。 在植物组织培养与快速繁殖过程中，植物激素能在很大程度上影响着植物体细胞胚状体的发生与发育。在培养过程中，一定量的植物激素是增殖分化、生根的必要条件，通常使用6-BA、KT、2，4-D以及NAA等较为常规的植物激素。6-BA和2，4-D利于愈伤组织分化成不定芽，且很快又分化为丛生芽。本次实验过程中，当6-BA与2，4-D的浓度比为3：1时，可以快速得到大量的丛生芽。于是在后面的继代增殖培养过程中，可加入适当的6-BA和2，4-D，以便提高增殖系数，增加丛生芽的数量及产率。解决白及种苗快速繁殖过程中增殖缓慢，导致种苗培养周期长等关键性问题，加大了推进都匀本地白及组培种苗产业现代化的进程。 另外，在本次实验过程中，还发现了在6-BA与NAA组合的培养基培养过程中，NAA浓度高的芽长得最粗壮。同时在这过程中，当没有2，4-D时，6-BA与NAA比列为2：1时，苗生根情况良好。 尽管前人对白及的组培快繁研究取得了不小的成绩，在白及人工快繁方面奠定了一定的基础，但是都匀本地白及的工业化生产任然受到限制。于是，本次实验利用白及种子通过植物组织培养技术，培养获得的再生苗为外植体。在前人研究的基础上，通过正交实验设计方法，对再生苗进行增殖培养，诱导再生苗增殖分化产生大量丛生芽。同时，对丛生芽进行生根培养，使其形成完整植株。通过植物组织培养建立都匀白及植株再生快速繁殖体系，白及种苗增殖系数高，解决了都匀本地白及种苗来源问题。可在原有投资基础上降低成本，大大的缩短了白及的培养周期。逐步实现都匀白及工业化生产，期望满足市场对白及的大量需求。 参考文献 邹娜，李意，连芳青. 优良观赏药用地被植物白及组织培养及快速繁殖研究J.江西农业大学学报，2013，35（5）：950-955. 李芳，肖小君，林忠全，等. 野生红花白及再生体系的建立和优化J.植物研究， 2015，35（6）：825-831. 徐中志，谭敬菊，陈翠，等. 不同白及?N源分析评价与利用研究J. 江西农业学报， 2011， 23（1）： 90-92 +96. 鲁光耀，杨仙，蒋瑞彬，等. 白及组培快速繁殖体系研究J. 浙江中医药大学学报， 2015， 39（5）： 383- 390. 林福林，杨昌云，杨薇薇，等. 中药白及的现代研究概况J. 中国医院药学杂志， 2013，33（7）：571-573. 陈娜，程磊，刘耀武，等. 近年白及组织培养的研究进展J. 郑州师范教育， 2014，3（4）：34-36. 石云平，赵志国，唐凤鸾，等. 白及愈伤组织诱导、增殖与分化研究J.中草药， 2013，44（3）：349-353. 林伊利，李伟平，马丹丹，等. 白及组培快繁的实验研究J. 中华中医药学刊， 2012，30（2）： 336 -339+ 450. 植爽，杜明林，贾黄，