艾滋病(HIV)检测方法汇总.docx

艾滋病（HIV）检测方法汇总一、 艾滋病简介艾滋病日的概念来源于1988年，全球卫生部大臣关于艾滋病预防计划的高峰会议上(W orld Summit of Ministers of Health on Programmes for AIDS Prevention)提出的。从此，这个概念被全球各国政府、国际组织和慈善机构采纳。从此，这个概念被全球各国政府、国际组织和慈善机构采纳。自1981年世界第一例艾滋病病毒感染者发现至今，短短20多年间，艾滋病在全球肆虐流行，已成为重大的公共卫生问题和社会问题，引起世界卫生组织及各国政府的高度重视。为号召全世界人民行动起来，团结一致共同对抗艾滋病，1988年1月，世界卫生组织在伦敦召开了一个有100多个国家参加的“全球预防艾滋病”部长级高级会议，会上宣布每年的12月1日为“世界艾滋病日” (World Aids Day) ;1996年1月，联合国艾滋病规划署(UNAIDS)在日内瓦成立;1997年联合国艾滋病规划署将“世界艾滋病日”更名为“世界艾滋病防治宣传运动”，使艾滋病防治宣传贯穿全年。二、 艾滋病（HIV）检测方法(一)抗体检测主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)。ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测，如果发现阳性标本应重复一次。为防止假阳性，可做Westernblot(WB，蛋白印迹法)进一步确证。WB法是用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离，再经传移电泳将不同蛋白条带转移于硝酸纤维膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，就能测出针对不同结构蛋白抗体，如抗gp120、gp41、P24抗体，特异性较高。快速检测法，也称为金标法，也是抗体检测的一种方法，根据免疫层析法的原理，用于HIV抗体检测的定性检测。(二)抗原检测用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原，来提高敏感性。(三)核酸检测用PCR法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。(四)病毒分离常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞诊断及艾滋病的研究中。三、 艾滋病（HIV）抗体、抗原检测HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现,可延续至终生15，血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验(WB)。常规实验方法：酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验(WestBlot)、间接免疫荧光法(IFA)。快速检测方法：明胶颗粒凝集试验、斑点免疫结合试验、P24抗原的检测、分子生物学方法、RT?PCR检测法、荧光实时PCR检测技术、支链DNA(bDNA)、连接酶酶促链式反应(LCR)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)1、酶联免疫吸附试验ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。2、免疫印迹试验免疫印迹试验主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS?PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原?抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。有报告说，免疫印迹试验的特异性不是很好, 有大约2%的假阳性率，但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。3、免疫荧光试验(IFA)基本原理为应用H?9或HUT?78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定，制备为抗原片,加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。4、明胶颗粒凝集试验(PA)PA的基本过程是先将样品稀释,然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒,混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊仪器设备,适合对少量标本的检测。5、斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤)斑点印迹试验一般采用硝酸纤维素膜作固相载体, 用HIV抗原包被于固相载体,加入待测标本(可为血清、血浆、尿液和其他体液),一定温度反应后洗去未结合于固相载体上的标本,包被抗原和被检血清中抗体结合,用胶体金(或胶体硒)代替底物连接在葡萄球菌蛋白A上,金标记蛋白A具有与人Ig结合的能力,因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有HIV抗体,则薄膜上就会产生一桔红色斑点(或线条),一般310 min出结果,特异性较好, 较为适宜于偏远地区临床用血检测,但不适于城市地区的献血员筛查。四、 艾滋病（HIV）检测时间艾滋病检测的最佳检测时间，对于艾滋病患者来说是一个非常重要的事项，因为患有艾滋病的人，在早期极少出现让人们感到异常的症状，所以常常被人们所忽略。一直到了发现症状的时候，艾滋病就已经到了晚期了，治疗已经极为不容易了。所以在感染早期，及时的进行艾滋病检测，是一项很重要的事项，他能帮助患者及早的发现艾滋病的症状 高危后，一般需要2-4周时间就可以检测出艾滋病HIV抗体。高危行为后，一般需2周时间即可检测出艾滋病抗体。也就是说2周后就适合作艾滋病检测。时间越往后，检测的准确性就越高(不同时间检测准确率、。 绝大多数被HIV感染的人，在4周后就能产生足够多的抗体，这个数量能够满足使用目前的HIV抗体测试方法检测出HIV阳性。五、 艾滋病（HIV）潜伏期自1981美国报道首例艾滋病患者以来, 艾滋病在全球范围内广泛传播, 严重威胁着人类的健康。尽管全世界对艾滋病的防治方法进行了大量的研究, 但至今仍未获得有效的预防药物和治方法, 因此对感染者从感染到艾滋病发病这一段潜伏期时间长度的研究对于了解艾滋病的然史、评价治疗效果、进行流行预测等方面都有着重要的意义。30年以来, 针对监测系统的不同监测数据, 对艾滋病潜伏期进行了大量的研究,提出了多种不同的方法, 不同方法对艾滋病潜伏期得出了不同的数据，所得到的艾滋病潜伏期结果普遍都在8-9年。至今为止，除了极少数未被确认的个体报告之外，还没有任何可证实的资料证明有短于1年或者长达20年的艾滋病潜伏期存在。OKHIV.COM编辑整理！六、 艾滋病（HIV）的临床分期1、急性期大部分病人在艾滋病感染初期，没有任何症状。但有一部分病人在感染数天至3个月后，有如流行性流感冒样或传染性单核细胞增多症样症状：发热、赛战、关节疼、肌肉痛、呕吐、腹泻、喉痛等，一般在艾滋病毒感染后2至8周出皮疹，血中出现艾滋病毒抗体。最长约半年后出现抗体。2、无症状感染期在急性期后，没有临床症状，为无症状的健康人，但体内有艾滋病毒，又称为艾滋病潜伏期。此后，8年内将有50%的人发展为艾滋病。有报告称，1至7年内从感染病毒到发病，其比例依次为1.5%,5%,10%,15%,25%,30%和40%。儿童艾滋病潜伏期短，平均为12个月。这时用很敏感的方法检测艾滋病感染者浆中的病毒核醒量，可预测5年内发病的机率。3、艾滋病前期无症状感染期之后，出现明显的与艾滋病有关的症状和体征，有人称之为艾滋病相关综合征，也有人称之为持续性全身性淋巴腺病等。主要表现在：持续性的淋巴腺肿大，开始于颈部，其次为腋、腹股沟淋巴结等。一般少有两处以上淋巴结肿大者。体重减轻10%以上。周期性发热(38摄氏度左右)，常持续数月。夜间盗汗。发生单纯疱疹病毒、白色念珠菌(属真菌类)等各种感染。4、艾滋病期由于免疫系统被严重破坏，各种致命性机会感染、肿瘤等极易发生。病变可表面在肺、口腔、消化系统、神经系统、内分泌系统、心脏、肾脏、眼、关节、皮肤等等。已发生机会性感染者，平均存活期为9个月。七、 病毒检测方法的发展1、核酸检测方法研究进展随着分子生物学技术的发展，核酸检测越来越受到人们的重视并将其与抗原抗体反应的高特异性结合起来形成了免疫PCR技术。这一技术具有特异性强和灵敏度高的特点，可用于单个抗原的检测。这促进了应用PCR技术进行HIV核酸检测的快速发展。自2001年起25，COBAS Ampliscreen HIV? 1 Test等4种HIV核酸检测技术通过了FDA的批准，作为进筛选分析技术来进行HIV?1的检测。最近，实时荧光PCR检测技术的应用使HIV核酸检测技术又进入到一个新境界26。通过这种技术，不但可以进行定性检测，更重要的是可以进行定量检测。Barletta等将这一技术应用到HIV的检测中，大大降低了病毒载量的检测限(0.66个拷贝相当于0.33个病毒粒子)。2002年4月国家药品监督管理局(SDA)批准了第一个HIV荧光PCR检测试剂盒。2、p24抗原检测方法研究进展随着检测灵敏度不断提高， p24抗原的检测逐渐从主要用于在窗口期辅助早期诊断和进一步缩短窗口期，发展到用于病毒载量测定。目前，p24抗原在以下几方面都有重要应用：HIV?1抗体不确定或窗口期的辅助诊断;HIV?1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断;第4代HIV?1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV?1抗体确认阴性者的辅助诊断;监测病程进展和抗病毒治疗效果。但现有监测病程进展和抗病毒治疗效果均采用昂贵、操作复杂的病毒RNA测定方法。我国HIV/AIDS患者绝大部分是在基层，检测1次病毒载量需要上千元(约1 500元)，很难在基层普及，对疾病的治疗和控制很不利。高灵敏度p24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家使用的病毒载量测定方法的一种选择。近几年，国外对建立高灵敏度检测p24抗原的研究一直没有停止，如为了提高检测血清中p24抗原的敏感性，将血清中免疫复合物解离后再进行测定，发展了ICD p24抗原测定法。2003年Sutthent27等将免疫复合物热解离后通过TSA信号放大系统使用ELISA进行检测，使p24抗原检测的最小检出值由原来的10 pg/mL降低到0.5 pg/mL，在HIV?1抗体阳性母亲所生婴儿早期的诊断中与RNA检测相当，与HIV核酸检测具有可比性，具有重要的实用价值。2004年，来自HIV病毒的发现者之一美国马里兰大学Dr.Robert C.Gallo所领导的实验室的一篇高灵敏度检测p24抗原的研究论文引起了广泛的关注，p24抗原的检测成为比病毒核酸检测更灵敏的方法。2005年来自美国马里兰大学的一篇长篇综述也开始关注p24抗原的检测，认为这可以作为低成本、适合在发展中国家使用的替代现有昂贵的RNA测定方法的一种选择。目前，商品化的p24 抗原的标准检测方法主要是依据夹心ELISA原理。