课件：药物定量分析与分析方法验证(1).ppt

药物定量分析与分析方法验证,一、掌握定量分析方法验证的效能指标。 二、熟悉定量分析样品的前处理方法。 三、了解定量分析样品的前处理方法的进展 及在药物分中的应用。,基本要求,第一节 定量分析样品的前处理方法 第二节 定量分析方法特点 第三节 药品质量标准分析方法验证 第四节 生物样品分析方法的基本要求,主要内容,概述,（一）直接测定法 例如：富马酸亚铁 溶于热稀矿酸，采用铈量法 ，邻二氮菲作指示剂,不经有机破坏的分析方法,（三）经氧化还原后测定法 1. 碱性还原后测定 例如：泛影酸的含量测定 2. 酸性还原后测定 例如：碘番酸的含量测定 Zn还原 后银量法,3. 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 （1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定 Sb5+ + 2KI Sb3+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 （2）含铁药物 2Fe3+ + 2KI 2Fe2+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6,H+,经有机破坏的分析方法,适合对象：含金属、X、N、S、P等有机药物，与C原子结合牢固 分类： 湿法破坏：主要用于含N有机药物；主要以硫酸作为分解剂，并结合氧化剂（硝酸、高氯酸、过氧化氢、高锰酸钾等） 干法破坏：,凯氏定氮法原理,NH2硝化生成NH4： 与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 用已知浓度的H2SO4（或HCl）标准溶液滴定，根据酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量,消解剂,作用：缩短消解时间，避免铵盐分解。 硫酸钾：提高硫酸沸点，以提高消解温度； 催化剂：汞盐、硒盐、铜盐等，其中以硫酸铜最常用。 对于含氮杂环结构，消解中需要加入辅助氧化剂，使分解完全并缩短消解时间，常用为30%过氧化氢和高氯酸。,仪器装置与操作,药物 硫酸钾 硫酸铜 硫酸,半微量法,/spxy/foodanalysis/swf/mnsy06.swf,注意事项,样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。 消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。 在整个消化过程中不要用强火。保持和缓沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。,干法破坏,适用范围：主要用于含X、S、P等有机药物，也用于含硒和砷盐的检查 分类： 1）高温炽灼法： 高温灼烧灰化转变成无机元素或盐； 主要用于：含X、P和砷盐检查 2）氧瓶燃烧法,高温炽灼法,原理：将待测元素有机药物在密闭的燃烧瓶中充分燃烧，彻底分解成CO2和水，而待测元素转化成不同价态的氧化物（或无氧酸），被适当吸收液吸收后采用适宜方法分析。 仪器装置：500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质玻璃锥形瓶 吸收液的选择：用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2,氧燃瓶燃烧法,吸收液的选择,应用示例：碘苯酯的测定,返 回,定量分析方法特点,一、容量分析法 （一）容量分析法的特点 操作简单、快速； 比较准确（RSD0.2%）； 仪器普通易得。,（二）容量分析法的计算问题 1. 滴定度（T）的概念 每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的量(mg) 2. 滴定度的计算 aA + bB cC + dD T = Mb/aB 3. 百分含量的计算 （1）直接滴定法 D% = V F T/W 100% F = 实际标定的浓度/规定的浓度 （2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法） D% = （VO VB) F T/W 100%,二、光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法（200nm760nm) 灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特点 准确度高，SRD（%）为2% 5% 仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用 范围广。 2.比耳-朗伯定律 A = ECL E1%1cm = 10/M,3. 仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73, 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm 或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。 吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml 波长(nm) 235(最小) 257(最大) 313(最小) 350(最大) E1%1cm 124.5 144.0 48.62 106.6 杂散光检查： 试剂 浓度(g/ml) 测定波长 透光率(%) NaI 1.00 220nm 0.8 NaNO2 5.00 340nm 0.8,4. 对溶剂的要求: 220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上 溶剂+吸收池A 0.41 0.20 0.10 0.05 5. 测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 0.7 对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=CxD/W100 % 常用方法 吸收系数法： 计算分光光度法：,（二）荧光分光光度法 灵敏度高，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用 1. 特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多。 制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。 用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广。,2. 荧光分析仪 有二个单色光器激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。,3. 含量测定 常用的方法对照品比较法:Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) Cr Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。,三、色谱分析法 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 方法分类 按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC （一）HPLC法 1. 对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系统性试验 分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.9 1.05 重现性：,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3. 测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法,应用示例： RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法 如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法,（二）GC法 1. 对GC仪器一般要求 载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系统性试验 分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.9 1.05,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3. 测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 应用示例： Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注 射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正 因子测定含量。,返 回,一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示 （一）含量测定方法的准确度 1. 原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。 2. 制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。,药品质量标准分析方法验证,空白回收率 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M 加样回收率 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,（二）数据要求 回收率% = （测定值-空白值）/加入量100% 具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价回收率的RSD3 %；用UV和HPLC法时，一般回收率要求95%105 %,二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度。 （一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) 2. 标准偏差（standard deviation, SD或S） 3. 相对标准差(relative standard deviation, RSD)也称变异系数(coefficient of variation, CV),（二）重复性、中间精密度及重现性,1. 重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度。 3. 重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。,（三）数据要求 应报告S或SD、RSD和可信限。用统计学的可信性分析(t或f）。,三、专属性 是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下， 采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检 查、含量测定方法，均应考察其专属性。 （一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分 的样品均应呈现负反应。,（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能 获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂 质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进 行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,四、检测限（limit of detection, LOD) 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。 五、定量限（limit of quantitation, LOQ) 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ.常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。,六、线性 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 UV法：首先制备标准系列，浓度点n =5; A=0.30.7 建立回归方程C = aA + b ;r 0.9999。 HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n =5 7; 以C对h或A或与内标物的峰面积之比，建立回归方程r 0.999。,七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法 适用的高低限度或量的区间。,原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80% 120%。 制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%- 130%。 溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20%。,八、耐用性 是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。 HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。 GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。,分析方法效能指标的具体应用： 1. 用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。 2. 用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法： 用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。 限度检查：除检测限、专属性、耐用性要求外，其余不要求。 3. 原料、制剂及溶出度测定：不要求检测和定量限，其余均要求。,返 回,一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术 三、定量分析方法验证,返 回,生物样品分析方法的基本要求,1. 血样 血浆：加抗凝剂，凝固后离心 血清：放置凝固 全血：加抗凝剂混合，不离心 贮藏条件：冰箱冷藏或冷冻-70度 2. 唾液 加碱除去黏液，降低粘度 3. 尿样 注意饮食对尿样的影响； 立即测定，否则加入防腐剂贮藏,一、常用样品的种类、采集和贮藏,二、生物样品分析前处理技术,1. 除去蛋白质 有机溶剂沉淀法：1:3 中性盐沉淀法：硫酸铵、硫酸钠、磷酸盐 加入强酸：pH低于等电点 铜盐或锌盐沉淀法：高于等电点 酶解法： 2. 结合物的水解 酸水解或酶水解 3. 有机破坏 结合牢固的金属离子,4. 分离、纯化与富集 液-液萃取：有机溶剂1-2:1，注意pH值对萃取的影响 液-固萃取：乳化少、萃取效率高，填料：正相（硅藻土）和反相（活性炭、C18） 组分富集：减少萃取体积、 样品浓缩、柱切换技术,三、定量分析方法验证,1. 特异性 是原物质、无干扰 2. 标准曲线和线性范围 3. 精密度：批内15%，批间20% 4. 准确度：85-115 5. 定量下限： 6. 样品稳定性： 7. 提取回收率：因为多了提取处理,思考题,测定方法的效能指标包括哪些？ 精密度表示方法有哪些？ 什