尿中多环芳烃测定课件

尿中多环芳烃（PAH)四种羟基代谢物 -高效液相色谱法(HPLC),杨玲 刘丹丹 康静,多环芳烃简介,多环芳烃(PAHs) 是人类最早发现的一类环境有机致癌化合物。PAHs 广泛存在于空气颗粒物和烟熏烧烤类食品中。另外,香烟烟雾中也含有高浓度的PAHs。PAHs 种类繁多、在环境中分布广,主要通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体,经体内代谢转化后,生成DNA 加合物。PAHs 与人们的生活息息相关，在致癌类化合物中占有相当重要的地位。,检测指标,那么如何评估人体内外PAHs的暴露量呢？ 目前使用较多的是生物标志物法，即通过测人体组织或体液中的PAHs或其代谢产物综合反映人体对PAHs的暴露情况。许多生物标记物，包括PAH-DNA、PAH-蛋白质、PAH尿代谢物等，都被用于衡量人体PAHs暴露量。,PAH进入人体后，经代谢形成多种代谢产物。可通过测定尿中四中代谢产物来反应内暴露情况。,2-羟基萘 2-羟基芴 9-羟基菲 1-羟基芘 1羟基芘是常用的生物标志物，它是芘的主要代谢物，在尿样中通常以葡萄糖醛酸酯和芳基硫酸酯的形式存在。 用HPLC来进行四种物质的定量测定，需在上机前对样品进行严格的处理。,上机前尿样处理步骤：,取尿样6ml于 15ml离心管,离心2000rpm/min 10min,取上清5ml,调PH 5.005.09后，加醋酸盐缓冲液 和-葡萄糖醛酸酶,37水浴摇床，14h,离心后，进行固相萃取,固相萃取用的装置,固相萃取用碳18柱,碳18颗粒,第一步：活化（5ml纯甲醇） 第二步：平衡（5ml超纯水） 注意：每一步操作要在上一步 液体到达上筛板之前加入！,调节滴速 每秒3-4滴,上样,第一步：吸附 （5ml尿样） 第二步：清洗 （10ml超纯水） （10ml30%甲醇）,洗脱,加两次3ml纯甲醇 记录每个试管液面高度（6ml左右）,氮吹,用氮气将试管吹干 （6小时左右） 用70%甲醇1ml溶解后倒入1.5mlEP管中，上机前先离心，取200ul于棕色瓶。,上机,高效液相色谱法,色谱法的原理：利用混合物在流动相（甲醇）和固定相（碳18）中分配系数不同，使固定相（碳18）对各组分（ 1羟基芘 、9羟基菲、2羟基芴、2羟基萘）的保留作用不同，产生差速迁移，使各组分得到分离。流动相在开机前需进行脱气处理。 差速迁移：在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定相作相对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之间的作用力（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和亲和力等）有微小差别，使得不同组分被流动相运载移动的速率不同，产生差速迁移，致使性质有微小差异的不同组分被分离。,组分分配在固定相中的浓度,组分分配在流动相中的浓度,K=,K值大小与组分的保留时间有关，即与峰形出现的时间有关,分配系数：在一定温度和压力条件下，组分在固定相和流动相之间的分配达到平衡时，组分分配在固定相与其分配在流动相中的平均浓度之比。,高效液相色谱法,是利用高压输液泵驱使流动相（甲醇）通过装填固定相（碳18）的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。 液固吸附色谱法 在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。,高压输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,贮液瓶,高压输 液泵,梯度洗 脱装置,色谱柱,高效液相色谱仪的工作流程：,高压泵将贮液器中经过过滤和脱气的流动相经由进样器送入色谱柱，然后从检测器流出。 当注入欲分离的样品时，流经进样器的流动相将样品带入色谱柱中进行分离。分离后的各组分依先后顺序进入检测器，检测器将个组分浓度信号转变为易于测量的电信号，经色谱工作站处理得到色谱图。,梯度洗脱装置（溶剂程序）,在分离过程中，流动相的组成随时间改变而改变，按一定程序不断改变流动相（甲醇）的配比，使溶剂极性、离子强度或pH值改变，使被测组分的相对保留值得以改变，从而改进复杂样品的分离，改善峰形、缩短分析时间，提高分离效率。 本实验选择荧光检测器，因为其对温度和流动相流速的变化不敏感，可以进行梯度洗脱。,溶剂的梯度洗脱程序,荧光检测器波长的选择,2-羟基萘Ex：227nm Em：335nm 2羟基芴Ex：275nm Em：330nm 9-羟基菲Ex：255nm Em：385nm 1羟基芘Ex：242nm Em：396nm,柱温,色谱图： 是电信号对时间的曲线，又称色谱流出曲线。,色谱峰：色谱图中最突出的部分。 正常的色谱峰，是对称正态分布的曲线。 基线：仅有流动相通过检测器时，仪器记录的响应信号曲线。 横坐标：保留时间(T)，组分从进样到出现信号最大值的时间。 纵坐标：响应信号（