核酸及核酸分子杂交1ppt课件

第一章,核酸的分子结构、性质和功能,主要内容,第一节 核酸是遗传物质 第二节 核酸的结构 第三节 核酸的功能 第四节 核酸的变性、复性和杂交 第五节 病毒核酸 第六节 反义核酸,第一节 核酸是遗传物质,核糖核酸（RNA）,脱氧核糖核酸（DNA）,核酸,Griffith 1928年发现了DNA为遗传物质,Avery 1944年证明了DNA为遗传物质,Watson和Crick 1953提出了DNA双螺旋,第二节 核酸的结构,一、DNA的结构 一级结构、二级结构、三级结构、拓扑结构 二、RNA的结构,一级结构,DNA分子的脱氧核糖核苷酸残基的排列顺序,三级结构,DNA中单链与双链、双链之间形成的三链或四链结构,拓扑结构和四级结构,拓扑结构：正超螺旋、负超螺旋 四级结构：DNA与一些蛋白质因子相互作用形成的结构,第三节 核酸的功能,一、DNA的功能 二、RNA的功能 (一) hnRNA和mRNA的功能 (二) rRNA的功能 （三）tRNA的功能 (四) snRNA、scRNA （五） 核酶,第四节 核酸的变性、复性和杂交,一、核酸的变性 二、核酸的复性 三、核酸的杂交与应用 四、生物芯片基因芯片,三、核酸的杂交与应用,杂交含义：序列互补单链的RNA和DNA，或DNA与DNA，或RNA和RNA，根据碱基配对原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程 杂交 Southern 印迹 Northern 印迹 Western 印迹 原位杂交,杂交,（一）探针及其标记物 （二）影响杂交的因素,探针及其标记物,1、（核酸）探针（probe）：指带有标记物，能与被检测的核苷酸片断互补的一段已知核苷酸片断。 理想探针必须具备以下几点： 探针必须是一段已知的核苷酸序列 必须加以标记，便于杂交后检测,探针及其标记物,探针标记物可分为放射性和非放射性两大类 放射性核素标记：32P、3H、35S等 非放射性标记物： （1）生物素：与UTP和dUTP嘧啶环的5位碳相连 （2）光敏生物素 （3）地高辛：类固醇半抗原化合物，与嘧啶环相连 （4）荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）呈黄绿色荧光，试卤灵呈现红色荧光、羟基香豆素呈现蓝色荧光,影响杂交的因素,探针的浓度和长度：浓度0.5-5.0ug/ml，探针长度50-300bp 杂交的温度和时间：比Tm低20-25C，杂交时间16h 杂交液中的甲酰胺：降低杂交溶液温度 离子强度：0.1mol/L Na+，盐浓度越高，杂交率越高 非特异性杂交反应：对非特异性位点进行封闭，常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA；一些高分子化合物，如Denhardt氏溶液，脱脂奶粉,Southern 印迹,具体步骤 1、待测核酸制备 2、限制性内切酶的消化 3、琼脂糖凝胶电泳 4、原位DNA变性 5、DNA转移至硝酸纤维素滤膜 6、预杂交 7、杂交 8、洗脱 9、放射自显影,3、琼脂糖凝胶电泳,分离大分子DNA片段（80012000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%）凝胶 分离小分子DNA片段（5001000bp）用高浓度琼脂糖（1%）凝胶 分离300500bp DNA片段用1.3%浓度琼脂糖凝胶,4、原位DNA变性,将电泳后的DNA凝胶置于碱溶液中浸泡15min，使双链DNA变为单链DNA 然后，换到中和缓冲液中浸泡30min。,5、转移,将DNA转移至硝酸纤维素膜上 裁一张硝酸纤维素膜、24张滤纸和一些吸印纸，都与胶大小相同 A将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。 B将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。 C将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。 D用保鲜纸封住凝胶四边。 E将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。 F将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物 G转移几小时或过夜(至少4小时),转膜,6、预杂交,将膜上所有能与DNA和一些大分子物质结合的位点全部封闭。 一般用变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。 另一类是用一些高分子化合物，一般用Denhardt氏溶液（含聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白），也可以用脱脂奶粉,7、杂交,将放射性核素标记的变性后DNA探针进行杂交，杂交一般在较高的盐浓度及适当的温度下进行数小时或几十小时,核酸杂交流程图,Northern 杂交与southern不同之处,1、RNA在凝胶电泳时须经变性处理 2、电泳结束后，RNA不经任何处理，可直接转移到膜上 3、RNA-DNA杂交不如DNA-DNA杂交强烈 4、在RNA电泳中，18S和28S的大小可以作为一项指标检测RNA的质量状况,四、基因芯片,概念：基于碱基互补原理，在固体硅片或玻璃芯片表面用大量的基因探针按一定的序列集成的芯片 基因芯片的主要类型： 基因芯片的杂交及检测 基因芯片的应用,基因芯片的主要类型,根据支持物不同：无机片基和有机片基 根据探针阵列的形式：原位合成和预先合成然后点样 根据芯片的功能：基因表达芯片和DNA测序芯片,基因芯片的杂交及检测,杂交,杂交信号,基因芯片的应用,基因表达的检测 基因突变分析 基因测序 寻找新基因 测定基因的多态性,第六节 反义核酸,一、反义核酸概述 二、反义技术 三、反义核酸应用 四、RNAi,一、反义核酸概述,（一）概念:根据碱基互补原理,用人工合成或生命有机体合成的特定互补的DNA或RNA片段。 （二）反义核酸作用的部位： 1、与基因组DNA结合 2、与引物结合，从而在复制水平上抑制基因表达 3、mRNA 5端非翻译区，编码区，帽子形成位点 4、前体mRNA外显子与内含子结合部位 5、polyA形成部位,一、反义核酸概述,二、反义技术,（一）概念:根据碱基互补原理,用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术。 （二）分类 1、反义DNA 2、反义RNA 3、肽核酸 4、核酶,1、反义DNA,含义：指人工合成的与待封闭基因的某一区段互补的正常或化学修饰的DNA片段，用来抑制或封闭基因表达 （1）正常DNA片段 （2）甲基磷酸型DNA片段 （3）硫代磷酸型DNA片段 （4）双硫代磷酸型DNA片段 （5）-构型DNA片段,1、反义DNA,2、反义RNA,含义：核苷酸序列与其所调控的RNA序列互补的RNA片段 抑制机制：它通过配对碱基之间氢键的作用，与对应的RNA形成双链复合物而影响RNA的正常修饰、翻译等过程，从而起到调控作用,3、肽核酸,含义：在特定肽链上连接不同碱基,即以类氨基多肽链代替核酸中核糖磷酸骨架,并按一定序列结合上标准的A、T、G、C碱基所形成的肽核酸,三、反义核酸应用,（一）抗肿瘤研究 （二）抗病毒研究 （三）其他应用，如用于研究细胞信号传递机制,RNAi,（一）RNAi的发现及作用方式 小干扰RNA（small inter