大学生研究训练(SRT)计划项目申请书(幅面,16K).doc

项目类别项目批准号附件： 山东农业大学大学生研究训练（SRT）计划项目申请书项目名称： 内生细菌Burkholderia cepacia Lu10-1 对桑炭疽病的防效研究 申 请 人： 冯正伟 所在学院： 林学院 专业年级： 2005级蚕学专业 联系电话：指导教师: 冀宪领 职称 副教授 批准日期： 年 月 日 山东农业大学大学生研究训练（SRT）计划项目管理委员会 填 表 说 明 一、 填写立项申请书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为16K本，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在学院审查并签署意见后报送学生创新基金管理委员会。三 、“所在单位意见”一栏中，应注明研究人员、时间、条件、政策等方面的保证措施和意见。“项目类别”指A、B、C、D，A学术论文、社会调查类；B全国、省级竞赛（决赛）类；C实验设计和科技制作、科研类；D其他类。“项目批准号”不填，由学校统一编号。四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称内生细菌Burkholderia cepacia Lu10-1 对桑炭疽病的防效研究 项目类别CA、学术论文、社会调查类； B、全国、省级竞赛（决赛）类；C、科学实验和科技制作、科研类； D、其他类。申请经费2000元起止年月2008.01-2009.06项目申请人姓 名冯正伟 学号20055302性别男出生年月86、07专业、年级、班级、蚕学05级一班学院林学院前一学期平均学分绩点275兴趣爱好篮球前一学期综合测评名次6电 导教师主要教学工作简历时 间授课名称授课对象学 时授课单位2008年桑树栽培及育种学本科36林学院2007年桑树栽培及育种学本科36林学院2006年桑树栽培及育种学本科36林学院主要科学研究工作简历时 间项目名称获奖情况20012003黄粉虫工厂化生产技术的示范应用，20032005蚕桑种质资源得收集、整理、研究与创新利用技术研究”2005-2007多粘类芽孢杆菌抗菌生物活性物质的分离及其结构的研究项目组主要成员不含申请者姓 名学号性别出生年月专业年级所在学院学习状况项目中的分工签字李长铭20051824男86、0405级蚕学林学优良Lu10-1防效测定王丹2004040004女85、0604级蚕学林学优良Lu10-1对桑炭疽菌拮抗作用测定蔡国军2004040283男85、1004级蚕学林学优良Lu10-1对桑炭疽菌拮抗作用测定二、立项依据（项目的意义、现状分析）项目的意义桑炭疽病 (Mulberry anthracnose)是由桑炭疽刺盘菌 (Colletotrichum morifolium)引起的一种严重的叶部病害，严重影响桑叶的产量和品质，给蚕桑生产带来巨大经济损失。近年来，由于栽培密度不断加大，桑树采叶强度增加，树体活力降低，桑炭疽病有不断扩展趋势，已成为桑园的主要防治病害。桑树是叶用经济作物，农药残留、病原菌抗药性以及对家蚕的饲养安全性的影响，限制了农药的种类、药效、残效期等的选择。近年来，对桑树炭疽病进行生物防治的研究已有报道，但国内尚未见有内生细菌作为桑炭疽病生防因子的研究报道。洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1是本实验室从桑树叶片中分离得到的一株内生拮抗细菌，其对桑炭疽病菌具有较强的拮抗作用，且能进入桑树体内稳定定殖，显示出较好的应用前景。 本研究旨在深入探明洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1对于桑炭疽病的生防功能，阐明其抑菌作用机理，为桑炭疽病的防治提供科学依据。现状分析 桑炭疽病在国内蚕区发生普遍，不少桑园发病严重。主要为害枝条中下部叶片，使桑叶发生枯斑或全叶枯黄。病斑初为褐色小点，后扩大呈暗红色不规则或近园形的病斑，边缘有时颜色较深，发病叶脉呈鲜红色，病斑部正反面散生由棕褐色到黑色的小点，即分生抱子盘，病斑扩大，联在一起，则叶片枯焦。目前，桑炭疽病的防治除了清除病落叶的措施外，生产中最多采用的是使用多菌灵可湿性粉剂或托布津可湿性粉剂等杀菌剂喷雾防治，关于桑炭疽病的生物防治，见报道的只有枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis），但国内尚未见有内生细菌作为桑炭疽病生防因子的研究报道。内生细菌作为生防因子相对于其它拮抗细菌而言有更大的优势，其优点在于以下几个方面：内生细菌占有有利于生防的生态位；内生细菌可以经受住植物防卫反应的作用；内生细菌与病菌可以直接相互作用，内生细菌系统地分布于植物体根茎叶花果实种子等的细胞或细胞间隙中，它可以直接面对病菌的侵染，对病菌的致病因子或病菌本身发起攻击,降解病菌菌丝或致病因子，产生拮抗物质，或诱导植物产生ISR抑制病菌生长。内生细菌的抗菌活性物质主要是抗生素和蛋白类。抗生素是一类异源小分子化合物，在低浓度下可以对微生物的生长或代谢产生影响。在植物病害的生物防治中，内生细菌产生的抗生素起着重要的作用。内生细菌产生的抗生素物质主要包括双乙酰藤黄酚 (Phl)，吩嗪羧酸 (PCA)，藤黄绿脓素 (pyoluterin), 吡咯菌素 (pyrolnitrin)和一类丁酰内酯 (butyrolac-ones)。真菌细胞壁的主要组成成份是几丁质和葡聚糖，内生细菌另一个重要的生防机制就是产生水解酶类，其可以降解真菌的细胞壁或其它致病因子如毒素等，达到防病效果。分离自橡树的内生细菌有些能产生几丁质酶抑制病菌的生长。某些生防菌的几丁质酶基因已经被克隆，可以将此基因转化到内生细菌中，提高内生细菌的防病效果 。 洋葱伯克氏菌是一种广泛存在于土壤、水和植物表面的革兰氏阴性细菌，分为9个基因型，合称洋葱伯克氏菌群（Burkholderia cepacia complex简称Bcc）。洋葱伯克氏菌在农业领域中具有生物防治、生物降解及促进植物生长等多种功能，该菌作为生防菌可以有效防治多种植物土传病害，如腐霉病菌（Pythium spp.）和镰刀菌（Fusarium spp.）引起的植物猝倒病害。Omar等发现Bcc结合低浓度的杀菌剂Carbendazim可明显减轻番茄枯萎病的发生，大大提高了防病效果，也降低了病菌抗药性发生的风险。DeCosta等从香蕉表面分离的一株Bcc菌株，可有效防治香蕉炭疽病，并结合热处理方法显著提高了病害控制效果。国外已经利用Bcc研制出了多种生物农药。国内，谢关林也曾在水稻上分离到多株Bcc菌株，发现它们能明显抑制水稻纹枯病菌的生长。郑维等20从堆肥样本中分离的Bcc菌株CF-66对立枯丝核病菌、尖镰孢（F.oxysporum）以及酵母菌 (Candida albicans)等表现出了很强的抗菌活性。 目前还没有关于桑树内生细菌的研究报道，也未见洋葱伯克氏菌用于桑树炭疽病的研究。 三、项目实施方案及实施计划项目实施方案1.内生菌株Lu10-1对桑炭疽菌拮抗作用测定 内生细菌Lu10-1对桑炭疽菌的拮抗作用采用平板对峙法进行测定，首先将Lu10-1接种在PDA平板上，28培养48h后，接种桑炭疽菌，28培养一周后观察抑菌效果。2内生拮抗细菌Lu10-1对桑炭疽病原菌菌丝生长的影响 采用平板对峙培养法，取桑炭疽病原菌菌饼倒置PDA平板中央，内生细菌Lu10-1用接种针点接在PDA平板边缘距中心25mm处，每个处理重复3皿，28培养3d后。挑取抑菌带边缘的菌丝，观察菌丝的被抑制情况。3内生拮抗细菌Lu10-1对桑炭疽病原菌孢子萌发的影响 将发酵液离心后取上清液, 用0.22m微孔滤膜除菌。无菌滤液按11(V/V)同桑炭疽病菌孢子悬浮液混合(孢子含量为5105个/mL)，同时以未接菌的LB培养液以相同比例与桑炭疽病菌孢子悬浮液混合作对照，26下培养，于6h、12h、24h后镜检其孢子的萌发，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时被记录为萌发，每处理重复3次，计算孢子萌发抑制率；在观察被抑制分生孢子的结构变化。4 内生拮抗细菌Lu10-1室内防效测定4.1内生拮抗细菌Lu10-1发酵液喷施浓度试验：将发酵液稀释成不同的浓度，喷施桑树叶片，然后接种病原菌，温度为28、相对湿度为80%的环境中保湿5d，采用十字交叉法测量病斑直径，计算病斑抑制率，确定最佳喷施浓度。4.2 内生拮抗细菌Lu10-1发酵液喷施时间试验：将炭疽病病原菌配成浓度约为1 108cfu /mL 的菌体悬浮液对桑树叶片接种，分别在接种前1、3、5、7和接种后1、3、5、7天喷施Lu10-1发酵液。计算病斑抑制率，确定最佳喷施时期。5 内生拮抗细菌Lu10-1大田防治试验 在山东农业大学蚕桑科研基地将桑树播种，待桑苗长出4到5片时进行试验。试验方法同室内试验。实施计划本课题计划用一年半的时间完成，具体安排如下：2008.12008.6 内生拮抗细菌Lu10-1对桑炭疽病的内生菌株Lu10-1对桑炭疽菌拮抗作用测定；2008.62008.12 内生拮抗细菌Lu10-1室内防效测定；2009.12009.6 内生拮抗细菌Lu10-1大田防治试验。四、预期成果预期研究结果1、明确内生拮抗细菌Lu10-1的对桑炭疽病的防治作用。2 初步探明明确内生拮抗细菌Lu10-1对桑炭疽病病菌的拮抗机制。3、明确内生拮抗细菌Lu10-1的对桑炭疽病的防治应用中的具体技术。五、本项目的特点与创新之处桑树植物体内内生真菌的应用国内外还未见报道，属创新性研究。本课题集作物栽培、植物病理、微生物的分离培养等研究与一体，是涉及多个学科，可以充分培养、锻炼和检验大学生的知识结构和能力水平。六、项目研究基础主持人与本项目相关的专业知识积累和已取得的成绩。指导教师的教学、科研工作积累和已取得的工作成绩。项目组成员的学习情况。主持人与本项目相关的专业知识积累和已取得的成绩：项目主持人学习掌握本课题研究所需的基本知识（生化、桑树栽培、有机化学、分析化学、微生物学、桑树病虫害等）并参与指导教师的部分科研工作，具有一定的工作经验。查阅了大量文献资料，掌握了与本项目有关内容的国内外研究进展，设计了周密可行的研究方案。现已从桑树叶片中分离得到的内生拮抗细菌洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1对桑炭疽病菌具有较强的拮抗作用，其能进入桑树体内稳定定殖且可在桑树各组织器官中转移和传导指导教师的教学、科研工作积累和已取得的工作成绩。指导教师多年从事本科生的教学工作，具有丰富的指导经验；先后参与完成多项省、部、国家级课题，发表论文20余篇，具有较高的科研能力；指导教师曾指导2001级学生完成一项大学生SRT计划，具有一定的指导经验。项目组成员的学习情况：项目组成员学习优秀，已经掌握课题所需的基本知识和技能，具有完成课题的时间、能力。七、经费预算试剂费1000主要用于内生菌和病原菌的培养等试验耗材500主要购买培养皿等