课件：DNA的损伤、修复和基因突变.ppt

第 5 章 DNA的损伤、修复和基因突变,2013.10.22,Chapter 5 DNA Damage, Repair and Mutation,1、DNA合成中负责复制和修复的酶是： 。 2、DNA复制过程中，连续合成的子链称为： ， 另一条非连续合成的子链称为： 。,DNA聚合酶,填 空,后随链,先导链,1、从一个复制起点最多可分出几个复制叉：( ) (A) 1； (B) 2； (C) 3； (D) 4； (E) 5；,单 选,B,2、大多数生物DNA的复制方式是：( ) (A) 滚环式； (B) D-环式； (C) 全保留式复制； (D) 半保留式复制； (E) 混合式复制；,D,1、下列关于原核DNA复制说法正确的是： ( ) (A) 按全保留机制进行； (B) 按3-5方向进行； (C) 需要DNA连接酶的作用； (D) 涉及RNA引物的形成；,C、D,多 选,第 5章 DNA的损伤、修复和基因突变 5.1 DNA损伤 5.1.1 DNA分子的自发性损伤 5.1.2 物理因素引起的DNA损伤 5.1.3 化学因素引起的DNA损伤 5.2 DNA的修复 5.2.1 切除修复 5.2.2 错配修复 5.2.3 直接修复 5.2.4 重组修复 5.2.5 SOS系统 5.3 基因突变 5.3.1 基因突变的类型 5.3.2 诱变剂的作用 5.3.3 诱变剂和致癌剂 5.3.4 基因突变的后果,5.1 DNA损伤 1）损伤的概念 生物体DNA双螺旋结构发生的任何改变。 分两类： 单个碱基改变 双螺旋异常扭曲 单个碱基改变只影响DNA序列,不影响整体构象，双螺旋分开时不影响转录或复制。 双螺旋结构异常扭曲对复制或转录产生生理损害。,9,引起损伤因素: 1. DNA本身在复制等过程发生自发性改变； 2. 细胞内各种代谢产物； 3. 外界物理、化学因素； 2）自发性损伤 指复制中配对差错,经聚合酶校对后仍存在的损伤。 如:大肠杆菌复制的误配率为10-110-2，经酶校正后降到10-510-6,再经DNA结合蛋白校正后，误配率降到复制后的10-10。,10,碱基自发性改变包括： 互变异构; 碱基脱氨基作用; 自发脱嘌呤和脱嘧啶; DNA聚合酶“打滑”; 碱基丢失; 活性氧引起诱变及代谢产物对DNA损伤。,互变异构 指碱基氢原子位置改变产生异构体， 使配对形式改变，在复制后子链上出现错误。 如： A 互变异构体 A与 C 配对， T 互变异构体 T与 G 配对 复制时模板如存在这些异构体，子链错误, 损伤。 碱基脱氨基 指C和G中都含环外氨基,有时自发脱落，结果 CU，GX, AI, 复制时子链中产生错误导致损伤。 AIC(非T)，下一轮 CG，导致ATGC CUA(非G) 下一轮AT， 导致 GCAT,12,脱氨试剂： 羟胺：体外诱变剂 亚硫酸盐：改变单链区的CU 【目前人工诱变用寡核苷酸指导诱变和 PCR 诱变取代亚硫酸盐诱导诱变】 亚硝酸盐主要使CU或A,G 脱氨基，特异性差，引起体内外广泛诱变。 DNA聚合酶的“打滑” 复制时发生的碱基环出(looping out)现象，即DNA聚合酶发生“打滑”(slippage)，引起一个或数个碱基的插入或缺失。 易发生在有几个相同碱基串联部位，产生严重的移码突变。,2019/3/14,活性氧引起的诱变 活性氧的氧分子电子数大于 O2 8 oxo G (OG) 为 7，8 二氢-8氧代鸟嘌呤（一种氧化碱基），可与C A,配对,poly,不能校正其错配，造成 GC TA 颠换。 H2O2是非常活跃的呼吸代谢副产物，能造成DNA氧化损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇,羟甲基尿嘧啶。,碱基丢失-自发脱嘌呤和脱嘧啶 DNA可自发水解使嘌呤碱和嘧啶碱从DNA磷酸脱氧核糖骨架上脱落。 【据统计一个哺乳动物细胞在37，20 h内经自发水解可从DNA上脱落约1000个嘌呤和500个嘧啶，在长寿命哺乳动物细胞(人神经细胞)整个生活周期中自发脱落嘌呤数约108，占细胞DNA总嘌呤数30。每个细胞每小时脱去的嘌呤碱和嘧啶碱数分别平均约为580个和29个】,2019/3/14,18,3）物理因素引起的损伤 紫外线(UV) 形成嘧啶二聚体，DNA最易吸收波长260nm左右，大剂量UV照射后一条链上相邻两嘧啶形成共价键的环丁烷嘧啶二聚体,相邻两个T或两个C或C和T间均可聚合，最易是TT。,人皮肤暴露在阳光下，每小时由UV而产生嘧啶二聚体频率5104 bp/cell,由于UV穿透力有限，对人体负作用主要是皮肤，但UV影响微生物存活。,4）电离辐射引起 DNA 损伤 直接效应：辐射后对DNA直接沉积能量，引起理化性质改变，特别是水，经辐射解离后产生不稳定高活性自由基，引起DNA损伤。 间接效应：指电离辐射对DNA存在的细胞环境中的其他成分沉积能量引起的变化。辐射严重后果是链断裂 辐射还能引起DNA交联，包括： 链间交联 DNA-蛋白质的交联 链间交联指DNA中两条链碱基间共价结合,物理诱变剂,22,5）化学因素引起的DNA损伤 1.烷化剂 是一类亲电子化合物，极易与细胞中大分子亲核位点反应。亲核位点： 腺嘌呤中 Nl , N3 , N6 , N7 ； 鸟嘌呤Nl , N2 , N3 , N7 ,06 ； 胞嘧啶的 N3 ,N4 ,和 02 ， 胸腺嘧啶 N3 ,02 和 04 。 其中：鸟嘌呤N7 位和腺嘌呤N3 位最易烷化，磷酸 二酯键中的氧也容易烷化。,有两类烷化剂： 单功能烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只与一个碱基作用形成单加合物； 另一类为双功能烷化剂， 例如氮芥，能同时与DNA中两个不同亲核位点反应，如果这两个位点在DNA双螺旋结构中的同一条链上，则产生链内交联。 若两个受作用碱基位于两条链，则链间交联。,2019/3/14,2.碱基类似物 结构与碱基相似能替代正常碱基掺入链中。 5-溴尿嘧啶 (5-BU) 在胸腺嘧啶是溴而不是甲基，与U结构相似，能与A配对。 5-BU 有酮式和烯醇式两种状态，烯醇式(频率高)与 G 配对，掺入链中，经互变异构产生突变，引起A-T=G-C 转换。 2-氨基嘌呤(2-AP) 正常酮式状态与T配对，烯醇式时与C配对。,化学诱变剂,生物诱变剂,DNA的修复,由于染色体DNA在生命过程中占有至高无上的地位，DNA复制的准确性以及DNA日常保养中的损伤修复就有着特别重要的意义。,5.2 DNA的修复 修复是生物细胞在长期进化中形成的一种保护功能，在遗传信息传递稳定性方面有重要作用. 修复系统主要有五种：,30,错配修复 错配修复对复制忠实性贡献很 大。该系统识别母链的依据来 自Dam甲基化酶，它能使位于 5-GATC序列中的腺苷酸的N6 甲基化。一旦复制叉通过复制 起始点，母链就会在开始DNA 合成前的几秒钟至几分钟内被 甲基化。,2019/3/14,之后，只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配修复系统就根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在DNA链，并在对应于母链已甲基化了的腺苷酸的上游鸟苷酸的5位置切开子链。再根据错配碱基相对于DNA切口的方位启动修复，合成新的子链DNA片段。,32,当错配碱基位于切口3下游端时，在MutL-MutS、解链酶、DNA外切酶或RecJ核酸酶作用下，从错配碱基3 端开始切除单链DNA直到原切口，并在Pol 和SSB作用下，合成新的子链片段。若错配碱基位于切口的5上游端，则在DNA外切酶或X作用下，从错配碱基5上游端开始切除单链DNA直到原切口，再合成新的子链片段。,碱基错配修复过程 示意图,33,例：E.coli 中甲基化酶引导的 修复错配系统. 修复过程：识别、切除和修补。 参与修复蛋白至少12种。 Mut S二聚体识别并结合错配部位，Mut L二聚体与Mut S组成复合物，沿双链向两个方向移动到GATC，并使DNA形成突环。 Mut H内切酶结合Mut SL，在未甲基化链GATC位点5端切开【如切开处位于错配碱基3侧，由外切酶I沿35切除；如切开处位于5侧，由外切酶沿53切除】,为校正一个错配碱基，不仅需要找错配碱基本身，还需从远在1kb外找未甲基化GATC，切除长达1000nt以上链。解螺旋酶和SSB协助解链。 新DNA链由DNA聚合酶合成 DNA连接酶连接修复产物。,人类细胞错配修复系统缺失将导致严重后果，最典型的例子是引发遗传性非息肉结肠癌 (HNPCC)，在美国大约每200个人中就有1人患之，占所有结肠癌的15%。 分析患病机理发现是由于微卫星序列不稳定所致，大约长度为14bp的串联重复序列（即DNA微卫星序列）在患者一生中会改变其大小(重复数目而非序列的长短)，且存在个体差异。,34,错配修复系统与微卫星序列不稳定之间的关系主要是在DNA复制中，因DNApol的“打滑”而引起短重复序列插入过多或过少，致使产生凸环，错配修复系统能识别并修复“打滑”造成的错误。但当系统出现问题时，凸环不能被校正。因此由细胞分裂而进行的DNA复制将导致许多基因发生突变。这种遗传不稳定性会引发癌症，尤其是控制细胞分裂的基因(癌基因和肿瘤抑制基因)发生突变。,2019/3/14,错配修复系统:系统有区分亲链和子链的识别标签，即甲基化酶可使DNA的5-GATC-3中腺嘌呤N6甲基化。当亲链甲基化的GATC被复制，新合成子链的GATC序列将延时甲基化，短时内子代DNA双链处于半甲基化状态。利用这个时间差，错配修复只对未甲基化子链进行修复。 参与修复的蛋白质至少有12种。,2019/3/14,切除修复 【较普遍】 概念：主要修复单个碱基缺陷（或短片段）的损伤。指在一系列酶作用下，将受损伤部位切除，以相应未损伤的另一链作模板，合成新链填补切去的部分，之后再将其连接的过程，是维持DNA稳定的重要修复方式。 修复过程涉及一系列酶促作用，有核酸内切酶、外切酶、聚合酶、连接酶。 步骤归纳为“切一补一封”。,切除修复(excision repair) 分为两种： 1）碱基切除修复(base-excision repair) 研究证明在所有细胞中都带有不同类型、能识别受损 核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上 的N-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位 点，统称AP位点。 一类DNA糖苷水解酶只对应于某一特定类型的损伤， DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA,由DNA聚合酶合成新片段，最终由连接酶连成新的被修复的链。,38,39,碱基切除修复有3步： 特异酶识别损伤部 位，水解苷键（连接发 生变化的碱基和脱氧核 糖-磷酸间的苷键）切除 该碱基； 聚合酶合成新链； DNA连接酶连接。,40,2）核苷酸切除修复(nucleotide-excision repair) 当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链间 无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。 损伤发生后，内切酶在已损伤核苷酸5和3位分别切 开磷酸糖苷键，产生一个由1213个nt(原核生物) 或2729个nt(人类或其他高等真核生物)组成的小 片段，移去小片段 由DNA聚合酶I (原核)或(真核)合成新片段， DNA连接酶完成修复中的最后一步。,(左)大肠杆菌（右)人类细胞中核苷酸切除修复过程,2019/3/14,切除修复与癌症发生有关 着色性干皮病患者对日光或紫外线特别敏感，易患皮肤癌，分析发现患者皮肤细胞中缺乏核苷酸切除修复有关酶系统，对紫外线引起的DNA损伤不能修复。说明切除修复系统障碍是癌症发生的原因之一。 【在已研究过的真核生物中都很相似，说明其在进化中高度保守】,重组修复【 属于先复制后修复】 是细胞对在复制起始时尚未修复的损伤部位可先复制再修复的一种方式。即先跳过损伤部位，在新合成链中留下一个对应于损伤序列的缺口，该缺口由DNA重组来修复。先从同源DNA母链上将相应nt片段移至子链缺口处，然后再用新合成的序列补上母链空缺。 大肠杆菌的rec 基因编码主要的重组修复系统，它的一个主要作用是重新启动停滞的复制叉。 例如：嘧啶二聚体，烷化剂引起交联和其他损伤可进行复制后修复。复制时因酶在损伤位不能通过配对合成子链，可先跳过损伤位，在下一个冈崎片段起始或前导链上再复制，结果造成子链损伤相应位置留下缺口，此缺口由重组来修复。,2019/3/14,重组修复中原损伤链并未除去。第二轮复制时，损伤部位缺口可通过重组弥补，直至损伤被切除修复消除。不断复制若干代，即使损伤始终未从亲链除去，在后代细胞群中也已被稀释，基本消除了损伤影响。,2019/3/14,直接修复 (direct repair)【修复嘧啶二聚体或甲基化DNA】 将被损伤碱基回复到原来状态的一种修复。 例如：在DNA光解酶(photolyase)作用下，将在光下或经紫外线照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二聚体及6-4光化物(6-4photoproduct)还原成为单体的过程。,直接修复的3种方式： 光复活 06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)直接修复 【O6-甲基鸟嘌呤是被烷基化了的碱基，它已改变碱基配对性质。在MGMT作用下，将甲基转移到酶自身半胱氨酸残基上，从而得以修复。甲基转移酶由此而失活，但成为其自身基因和另一些修复酶基因转录的活化物，促进表达。因此MGMT能防止DNA链烷基化导致的死亡和突变效应】 单链断裂修复,应急SOS反应 (SOS response) 应急SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。 许多造成DNA损伤、抑制复制的过程能引起一系列复杂诱导效应，称SOS反应. 包括：诱导DNA损伤的修复、诱变效应、细胞分裂的抑制、溶原性细菌释放噬菌体，细胞癌变等与SOS反应有关。 Weigle效应 20世纪50年代，Weigle发现用 UV照射的噬菌体感染事先经低剂量UV照射的E.coli，存活噬菌体数增加，出现多突变型,而未经照射的细菌存活和变异率都较低，证明经UV照射后诱导产生了这些效应。,2019/3/14,SOS诱导的修复系统包括两类： 避免差错的修复 SOS中的错配修复、直接修复、切除修复和重组修复都能识别损伤部位或错配碱基而消除，这些修复不引入错误碱基。SOS能诱导切除和重组修复中某些关键酶和蛋白产生，使之在胞内含量升高，加强切除和重组修复能力。 易产生差错修复 SOS诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，使之在损伤部位即使出现不配对碱基，复制也能继续进行，以保证细胞存活。,2019/3/14,SOS反应由RecA蛋白和LexA阻遏物互作引起。RecA蛋白由E.coli rec基因编码，是在同源重组中起重要作用的蛋白，也是SOS的启动因子。 有单链DNA和ATP存在时，Rec A蛋白被激活，促进Lex A自体蛋白水解酶活性。水解使许多与修复有关基因被激活而表达。 包括：UV损伤修复基因uvr A、B、O、rec A 和lex A 基因，编码SSB的基因ssb,与噬菌体DNA整合有关基因him A等等。 RecA是SOS初发动因子，功能相当于去阻遏物。RecA被激活后促进LexA自身的蛋白水解活性，LexA是许多基因的阻遏物。,紫外线激发了RecA辅蛋白酶活性； 有活性的RecA辅蛋白酶激活了结合在umuDC操纵子上的LexA蛋白 使LexA蛋白自体水解； 水解后的LexA蛋白从umuDC操纵子上释放下来； umuDC操纵子开放，合成UmuD和UmuC蛋白； 两者组成Umu D2C复合体，引发DNA修复的易错旁路。,2019/3/14,SOS反应其生理意义：DNA复制受阻时，避免因细胞 分裂而产生不含DNA的细胞，或使细胞有更多进行重 组和修复的机会。 SOS反应能诱导切除修复和重组修复中关键酶和蛋白 产生，使这些酶和蛋白在细胞内含量升高，加强切除和 重组修复能力。 SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶， 使之在DNA链的损伤部位即使出现不配对碱基，复制 也能继续，保证细胞的存活。,2019/3/14,SOS反应包括两方面内容： DNA的修复； 导致变异； 一方面，突变对细胞不利，但在受损伤和复制被抑制 时，DNA突变有利于细胞存活。 另一方面，大多数在细菌中诱导SOS反应的物质，对 高等动物都有致癌作用，如-射线、紫外线、烷化 剂、黄曲霉素等。而某些不致癌诱变剂又不引起SOS 反应，如5-溴尿嘧啶等。 据研究，许多癌变是由SOS反应诱变造成的。目前在 医药和食品上有关致癌物的一些简便检测方法就是根 据SOS反应原理设计的，因为在动物身上诱发肿瘤的 试验需要耗费较多的人力物力，且周期长，而细菌 SOS反应容易检测.,54,5.3 基因突变(mutation) 变异是DNA核苷酸序列改变的结果，包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，及不同DNA分子间交换而引起的遗传重组。 基因突变是在基因内遗传物质发生可遗传的结构和数量的变化，通常产生一定的表型。广义的突变包括染色体畸变和基因突变，狭义上就指基因突变。 遗传重组也可导致可遗传的变异，因此染色体畸变、基因突变、遗传重组是可遗传变异的基础。,DNA的突变（mutation）,1. Small-scale mutations a. substitutation（替换） b. deletion （缺失） c. insertion （插入） d. exon skipping（外显子跳跃） 2. The chromosome abnormality a. Numerical abnormality: Triploidy, Monosomy, Trisomy. b. Structural abnormality: Two breaks in a single chromosome can cause inversion, deletion or ring structure.,The substitution mutation,Deletion mutation,Insertion,Exon skipping,Splicing of an intron requires an essential signal: “GTAG“. If the splice acceptor site AG is mutated (e.g., A to C in this figure), the splicing machinery will look for the next acceptor site. As a result, the exon between two introns is also removed.,2019/3/14,60,基因突变的类型 1.碱基对置换-点突变 有两种： 转换 发生在两种嘧啶或两种嘌呤间； 颠换 发生在嘧啶与嘌呤间。 缺失突变 一个或多个碱基被删除，或较长核苷酸序 列丢失，难以回复。 插入突变 插入一个碱基或一段外来DNA。 移码突变 一个或多个非3整倍数碱基对插入或缺 失,使阅读框架改变，导致之后序列都错， 产物完失活，如出现终止密码子则使翻译 提前结束。,2019/3/14,同义突变 突变改变了密码子组成，但没改变编码aa(简并性) 如基因的密码CTA突变为CTG，则转录的mRNA中将由GAU变为GAC,但都是Asp密码子。同义突变不改变产物序列，对发生突变的染色体组既无益处也无害。又称无声突变或中性突变。 错义突变 突变改变了所编码aa的种类或位置，不同程度地影响蛋白或酶的活性。,2019/3/14,62,渗漏突变 突变基因产物尚有部分活性的错义突变，是表型介于野生型与完全突变型间的