二聚杯芳烃：一类新的主槽键合试剂.docx

二聚杯芳烃：一类新的主槽粘合剂Wenbin Hu,Caroline Blecking, Marijeta Kralj, Lidija S uman, Ivo Piantanida, and Thomas Schrader*摘要：一种新的DNA键合试剂被提出。阳离子基团作用于二聚杯4芳烃的上层边缘，并且灵活的烷基桥可以被三重乙酰基保护的杯4芳烃羟化四甲铵在相对短的合成序列中合成。（3-5步骤）。这些化合物把自己与双链核酸用非共价键连接，用微摩尔到微毫摩尔的作用力。带有延长氢键的胍盐基团比铵基更强大，并且苄胺系列优于苄氨基系列（见下）。新的配体能简单地区别于RNA和各种DNA，并且可以在紫外，可见光，荧光，CD和核磁共振谱中产生特性变化。特别是低聚核苷酸，超过100个碱基对的亲和力增强，从RNA（10微摩尔 Kd）AT-富（1微摩尔）GC-富 DNA双层(100-10纳摩尔)。溴化乙锭位移研究证实这种规律。CE50值非常低，比典型的键合剂精胺少300倍。化学计量法比之更高（一个杯芳烃二聚每两个BP），暗示了一个潜在的内部主槽的聚合配体。多数紫外/可见曲线显示一个倒置的形状，并且开始增强DNA化合物的吸收强度。DAPI位移研究表明一个杯芳烃二聚物可以被容纳在燃料加载的DNA中。RNA通过杯芳烃二聚物络合是由一个激烈的CD光谱过渡。从典型的形式A到优秀的结构B，这提供了主槽键合剂进一步研究的证据。配体的方向可以由NMR推导出来，并且可在1:1复合物的水里进行蒙特卡洛模拟再重现。关键词：杯芳烃 圆二色性 DNA识别 荧光探针 氢键 分子识别 紫外/可见光谱引言核酸识别是一个基本的生物过程。它是一个主要的先决条件的基因表达。所有转录因子和蛋白质调节在一个特定的DNA片段上并且促进或者抑制转录各自的基因。此外，无数其他自然产品专为DNA识别，正如同许多合成的试剂。这些化合物都被绑定到不同区域的双链核酸上，有着深远的生物影响。事实上，很高比例的临床药物抗肿瘤试剂都是DNA键合剂。他们的作用机制主要是依靠夹层（阿霉素）和双链中断的病变或交叉链接（举个例子，顺铂和环磷酰胺），但是这些都有严重的副作用。统称使用四种不同途径进行DNA识别：夹层进碱基对，非特定的绑定到糖磷酸盐骨干上，主副槽的插入。为解决一个特定的目的基因，后两个案例是有利的，因为，基本序列可被访问并且是可读的。Dervan等人已经开发出一种酰胺低聚物，能建立成对的氢键接触到所有的碱基对组合，并且能够阅读一个4-7个碱基片段在小沟槽里面。在游离的人类红血球，艾滋病毒转录，今后，可以有效地抑制病毒的复制。自然更喜欢使用更广泛的大槽，它有正确的尺寸去适应圆柱形的氨基酸螺旋线。蛋白质如锌指，亮氨酸拉链，螺旋状螺旋和螺旋循环螺旋结构都很好地适用于这个用途。碱基对的分子识别通过氢键发生，优先与碱基和氨基酸。这样的残留物进一步稳定了磷酸离子形成的复杂盐桥。在某些特定的情况下，拥有嘌呤的低聚核苷酸可以存在于Hogsteensites现有的双螺旋线然后形成三重螺旋，它阻止了调节蛋白质的途径。尼尔森介绍了一个更普通的和简化的概念，他设计了无电荷的肽核酸去形成（DNA）(PNA)2的三重结构。令人惊讶的是，很少有纯粹的非键合的主槽。Mascarenas等人结合了氨酸拉链或锌指作为同步大小的主槽固定，获得了对于双链DNA的选择性绑定。2001年，汉侬小组合成了能舒适地进入主槽的DNA。这个超分子亚铁离子的圆筒引起了DNA的弯曲和螺旋，并固定成三种稳定的连接点。另一个主要的无机构造是舒米的金原子簇，它引起了肿瘤细胞的坏死，并且被计算出能非常适合主槽DNA的维度。十年以前，阳离子杯4芳烃对DNA有很强的亲和力是被大家所知的。施耐德，恩伽罗和其他人合成了三甲基铵和胍盐片段，表明了可以通过电泳淌度实验得到络合物。然而，杯芳烃是否能识别磷酸盐离子一直被争论着，多重的静电相互作用力导致了DNA的弯曲，最后这个事实被AFM技术所证明。我们最近制得了用简单烷基间隔的聚苯胺基杯芳烃，并把它作为一种新的强有力的DNA键合物，研究了有和没有附加正电荷的对于扩展间隔的影响。结果表明这种关系可以被优化，DNA的大部分结构可以通过一个简单杯芳烃二聚物同时合成。这可能会为对DNA的序列识别铺平道路。提供这主槽插入可以被证明作为底层绑定机，并且间隔区可以用核酸碱基对的识别单元所替代。这个工作积累了大量的证据，来证明这个主要槽绑定模式。结果和讨论没有晶体或NMR的结构，所以确定一个新的DNA键合物的机理并不是一个微不足道的任务。夹层可以被排除因为最紧凑的捏锥构象是他的首选尺寸。然而，骨干识别和副槽插入必须被考虑作为可替换物对于提出的主槽绑定模式。为了这次调查范围的扩大，我们决定合成四种不同种类的杯芳烃二聚物，它们仅仅在上沿修饰的阳离子功能不同：苯胺基杯芳烃1和相关的胍盐片段2，如同氨基苯杯芳烃3和他们的胍盐片段4。苄系列的扩展展现了一个大的突破，朝着有关潜在的应用；与苯胺基原型形成对比，这个新的二聚物3和4有很好的水溶性，一直到毫克分子级别。他们的DNA关系大约比二聚物1超100多倍。胍盐离子的自然使用用来建立离子对加固的氢键，磷酸盐阴离子环绕在DNA主槽周围。精氨酸在这些残留物中是核心物质，用来做非共价的基础阅读。为了一个更好的比较，我们也合成了各自的单体杯4芳烃片段，引起八个测试对象，如同在方案1中描绘的那样。这些二聚物的合成由单体匀称的杯4芳烃胺M1和M2的准备开始。这些顺利地转换为相应的胍单体，M2和M4，通过XX的连续处理，紧接着在二氧己环的盐酸中温和水解。从M1和M3，一个简单地合成序列引起了相关的二聚。三重保护只让一种胺部分游离，这被允许用来在两端提供二氯反应，在三氟乙酸的叔丁氧羰基移除后，形成二聚杯芳烃胺类化合物D1和D3。胍盐二聚物的合成更复杂一些：化合物D2是由D1经过仔细的处理由六种相对应的物质处理最后温和的水解。化合物D4由三份胍制得，广泛的色谱净化，耦合，最后用盐酸处理。单体和二聚体被存储为各自的三氟乙酸盐或是盐酸盐。这些杯芳烃大体在他们的pK值上不同：两个胍盐二聚体显示pK值到了12，这个苄胺衍生物的pK值有10，但是苯甲胺衍生物的pK只有5（在第一次质子化步骤）。然而，在pH=7时，化合物D2，D3和D4本质上是六质子化的，而D1只带有两个正电荷，这是一个缺点如果DNA络合仅依赖静电吸引的话。另一个苯胺和苄胺系列的显著差异是他们的水溶性：化合物D1和D2仅能溶解在甲醇与水1:1的缓冲溶液中，而毫克数量级的D3和D4可以再生理盐负荷的水缓冲溶液中。二聚以及单体杯芳烃受到一个广泛范围的DNA和RNA在不同长度核酸基片键合实验的影响。除了肿瘤细胞的毒性评估，这些键合研究包括荧光滴定法，乙啡啶溴化物（EB）和DAPI的取代，紫外/可见光融解曲线法，圆形二色性光谱（CD），凝胶渗透色谱法（GPC），核磁共振，以及MD模拟。一起算进内，我们所有的结果支持着我们的假设，即被研究的杯芳烃是被插入主槽中的。（图1：用来说明DNA键合机理的二聚杯芳烃衍生物D1-D4的合成途径）荧光滴定：用新杯芳烃的荧光标记核酸的直接滴定导致了全体淬灭，并且显示了强力的键合能力。化合物D1，只有两个正电荷而不是六个，是一个例外。这将显示了主导静电贡献会大大地被高盐负荷衰弱。更重要的是，苄基系列物和苯胺基系列物有着相同的Kd值；在相同溶剂组成的直接比较显示了一个因素，100种有利的苯系杯芳烃，正离子是电子分离芳烃的核心。在这些系列中，胍盐衍生物显示了更高的关系程度在这么多胺眼生物中。这种效应很可能来自扩展的氢键，胍盐的手作为给予体，不仅能到达核碱基，同时也能横跨整个槽，并且触摸阴离子磷酸二酯骨干（见下自己建立的片段）。另一个明确的趋势就是很明显地，RNA比DNA的键合更弱一点，暗示了DNA的主槽有更好的适应体。（表1：选出的杯芳烃和寡核苷酸的关系用Kd值 表示）通常说来，复杂的化学计量学和配体电荷是相关的。因此，每个碱基对的二价D1离子的数目大约是1.8，反之，六价的D2、D3或者D4离子对碱基对的比例大约是0.6:1。一个在主槽内部的线性对齐的二聚物分子产生更小的化学计量数，但同时也留有很多空间未开发。因此，更高费用的杯芳烃二聚物特别被期待去DNA的内部主槽去形成聚合物。据推测，在他们的丁氧基尾部和芳烃之间有着有利的范德瓦耳斯的联系。然而，通过GPC分析，没有发现低聚物为二聚体。通过DNA长度，每个芳烃单元之间也明显增加，指向一个潜在的在松散链末端的夹紧效应。单体以相似的方式工作，因此有资格作为潜在的主槽键合试剂。众所周知，副槽空间上更难以接受笨重的客体，由于鸟嘌呤的存在。而甲基取代基在多边形的胸腺嘧啶伸到主槽。一个典型的副槽键合试剂因此特别喜欢多聚。我们研究的二聚杯芳烃的情况并不是这样的。因此排除副槽插入。生成一个初步的键合文件，广泛的生物小分子，包括多肽类和糖类，被筛选来应对二聚物D1并且显现了较小的亲和力。溴化乙锭位移分析：溴化乙锭是DNA电泳中典型的染色剂，它几乎每秒插入一个碱基对，并且在510纳米处受到激发，在595纳米处引起一个强的荧光发射。DNA嵌入试剂盒强力的槽键合试剂可以与之竞争并从它的络合点驱逐它，同时导致荧光发射的减少。特征值C50间接地与表面上DNA配体的键合常数成比例。较小的C50值表示一个优越的DNA亲和力。完整的染料位移由所有的杯芳烃衍生品得到，通过大约10微米的C50值。不只是库仑力使配体保持在适合的地方。在生理盐负荷，二聚DNA的相互作用只略微减弱。这是另一个强力的原因对于槽插入作为反对纯粹的磷酸盐离子识别。相比之下，骨干绑定如精胺和亚精胺，它们采用静电方式，特征CE50值在这些条件下高1000倍。我们把这个结果作为强有力的槽键合证据，作为新的疏水部分并且氢键可以被利用。再一次，没有深刻的差异在M1-4和二聚物D1-4中获得。（图形1：代表荧光滴定曲线/绑定等温线，RNA与DNA组成的区别）（表2）过渡到很长的寡核苷酸加重了核酸不同构象与空间位阻的区别。用这些材料，多聚通过杯芳烃是更好的键，多聚物和RNA比随即序列DNA更弱。这些平行研究结果表明一个极好的有广泛适应性的DNA主槽。紫外/可见光曲线：加热DNA方案导致紫外吸收的增长。它这个曲线的S形拐点被称为熔化温度Tm。这个值表示双螺旋的热稳定性。插入试剂和槽粘合试剂通常稳定DNA链，提高Tm值。这个对大多数融化的正常轮廓曲线检查了DNA衍生品完全改变在复杂的杯芳烃二聚体之间，特别是在甲醇包含的水缓冲溶液中。在D1-D4存在的情况下，倒的融化曲线出现大幅增加了初始紫外吸收对于杯芳烃的双链DNA复合物。（图形2：代表溴化乙锭位移的三条曲线）温度依赖性没有被发现在配体。这些变化通常建议参与DNA的发色团在复杂的杯芳烃中，举个例子，通过直接的氢键到NH组杯芳烃。在极个别情况下，拐点增加超过40，特别是在胍盐离子与杯芳烃，它可以跨越两个主槽。有趣的是，这个效应，很可能表明DNA稳定，是明显的短链DNA。（图形3：代表性的紫外/可见光融解曲线）这是最有可能的另一个争论链端螯合。这次杯芳烃单体的不足，几乎没有稳定DNA链。我们初步的解释是，这种行为有两点绑定模式的二聚物。这确保了连接两个磷酸二酯的脊椎。（表3：已选的杯芳烃的Tm和Tm变化值）圆二色谱：为获得更深的见解，绑定因变化引起的多核苷酸属性的杯芳烃。我们选择用CD谱作为一个高灵敏度的方法检测构象变化。此外，非手性的小分子可以最终获得一个感应CD谱绑定到多聚核苷酸上，这可以提供有用的信息对于他们的交换模式。CD光谱不同的DNA和RNA序列或没有测量杯芳烃配体在水溶液中缓冲。尽管杯芳烃单体和二聚体是非手性的，然而，CD未响应。摩尔椭圆率在所有波长都有所减少，和配体浓度成比例，这是一个可能的后果。（图形4：DNA左和RNA右的圆二色谱）（表4：槽宽度和深度）核酸螺旋的解除，同时伴随着槽的扩大，以适应化学试剂要求杯芳烃客体。椭圆形的演示，存在一个单一的，定义良好的，复杂的几何。杯芳烃单体的，受到他们的球形生产的影响。CD最大值不断在一个RNA与杯芳烃二聚物之间转移。最后，新的CD谱与B-DNA的极为相似。这个构象变化进一步解释说名降低能源成本。我们解释这个结果令人信服的证据是：假定主槽绑定机制的杯芳烃二聚体。DAPI位移分析：染料优先结合聚在DNA并导致形成一个强大的诱导效应。尽管DAPI绑定到次要的槽的DNA，其亲和力很平庸。因此一般用在DAPI位移实验拥有更强大的DNA绑定。杯芳烃D1-D4二聚体，他们的Kd值适合此类调查。因此，非常低的CE50值决定在荧光实验发现，有相当的EB。然而，CD实验显示，最初杯芳烃二聚物的化学计量数是绑定在DNA上的。这个实验，能重现很多次，表明DAPI和杯芳烃二聚物的化学计量数可以同时绑定在DNA。因为DAPI，其平面扩展占据了小槽，杯芳烃二聚体最有可能驻留在主要的槽。单体做则没有这样的效果。（图形5：DAPI位移）核磁共振实验：二聚物D1用不断增长的自补DNA链滴定。所有的芳香以及这个非对映异构的亚甲基质子杯芳烃配体随着化学位移变化，而丁氧基的尾端未受到影响。显然，杯芳烃的头穿透深入主槽，DNA改变了当时的磁场。铵离子与氮氧等杂原子间的氢键和这些CH质子化学位移变化相同。（图形6：核磁共振氢谱）当DNA的浓度增加，信号的扩大发生在杯芳烃的氢原子上，但是，再一次，主要是在芳香地区而不是丁氧基的尾端，甲基信号保持锋利。最有可能的是，这是一个动态效果，必须解释依照芳香顶部内的杯芳烃主槽，对着丁氧基的尾端，远离了DNA分子。信号的变换和线性展宽是有价值的有关DNA主体内部信息。它可能说明，这一假定键合模式是违反直觉的，因为一个良性分子配体应该占据更少的极性槽，把带电的铵基团放到大体积水中。不过，在聚阴离子双螺旋内部的负面点和密度中心坐落在两个沟槽之间，在核酸碱基的右上方。所有一直的棒状键合试剂因此吸入那个凹槽。丁醚和苯的尾端两一方面可以作为疏水接触区域周围的杯芳烃配体，构成宽松的聚合物驱填补宽敞的DNA主槽，并仍然保持灵活、移动。分子模型：立场计算强烈支持以上累计的实验事实。杯芳烃的二聚体是停靠在各种各样的主槽上的，但只有取上述的导致热稳定的复杂结构。蒙特卡洛模拟进行用1:1的复合物和双链寡核苷酸，使用宏观模型。图7描述了两个选择的最低能量构象。在所有结构中，铵盐和胍盐的配体与受体在DNA三重螺旋的碱基对形成一个网状的氢键，丁氧基的尾端从DNA分子离开。铵盐二聚体D1和D3和他们的核酸碱基形成氢键。扩展的胍盐手指阳离子二聚体D2和D4桥连九个BP。他们甚至跨越整个主槽并且到达对面的磷酸二酯阴离子。这些额外的交互解释了他们上级DNA的亲和力。额外的铵依附在烷基桥被推测用来进一步建立良好的氢键联系。扩散研究：为了调查在新的DNA键合物的潜在影响，四个不同的人类肿瘤细胞被培养：MCF-7，SW620，HCT116，和H460。在用单体和二聚杯芳烃72小时孵化后，细胞增长率通过执行一个细胞评价分析，查出了细胞检测脱氢酶活性，表5总结所表达GI50值。通常，抗恶性细胞增生活动越高，GI50值就越低。这些似乎是与指控的数量和溶解在细胞培养机制相关的。单体和苄胺的二聚物都很有效。所有的杯芳烃被用来清洗二甲亚砜的储备液，然后沉淀用来添加到细胞培养基。这是尤其重要的对于D1来说，它只带有二个正电荷。因此，结果可能源自有效配位体浓度，这远远低于计算值。（图形7：计算出的D1和D2的二聚体结构）尽管这些有用的数据，他们必须解释：细胞生长抑制可能源自DNA络合肿瘤细胞，但是它并不是牢不可破，因为阳离子杯芳烃可以通过细胞膜。另一种解释为抗增殖不能排除影响：当两性分子和二聚杯芳烃在细胞膜可能自组装，并且改变膜的潜力以及阳离子双层通道，因为杯芳烃头部已知与各种金属离子和阴离子相互作用。膜电位测量随着细胞周期分析将会解释更多方面。SERS实验和ITC测量：这两个实验技术被用来进一步调查这一新的二聚杯芳烃的络合行为。不幸的是，没有SERS谱可以从单体A和银胶体中被获得，最有可能是因为丁氧基尾端没有固定到银纳米颗粒的表面。同样的，在微量热测量中，热量的变化对于各种杯芳烃/寡核苷酸依然可以忽略不计。结论和展望这个调查专注于阐明这个新家族杯芳烃二聚体的绑定机制。尽管直接从晶体或者NMR谱获取信息还不能够，建立的DNA键合测定大纲由8个代表性的单体和二聚的杯4芳烃强烈支持在杯芳烃上沿阳离子部分和核酸基础部分进行主槽键合。因为大多数收集到的阳离子杯芳烃单体的键合实验数据强烈地符合这些各自的二聚体，似乎这些也更喜欢主槽的双链核酸。我们打算通过一个片段取代简单的杯芳烃之间的烷基桥梁，这个片段识别跨距的DNA范围的碱基序列。这个工作的最终目的是控制基因表达通过阻止特异性启动子序列。然而，修改后的二聚杯芳烃也可以演变为诊断工具和细胞毒性代理治疗肿瘤。感谢我们感谢Haberhauer集团对测量微摩尔级别有无杯芳烃的DNA溶液的圆二色谱做出的贡献。衷心感谢德国科学基金会的资金提供。这项工作也接受了克罗地亚科技、教育以及体育界的赠款（文2918，2514）。参考文献1 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This decrease is comparable to values obtained for the CD titration of AT polynucleotide with D4 alone (no DAPI added) and demonstrates, that D4 actually binds to the DAPI-loaded AnTn.40 Excess calixarene dimer subsequently pulls DAPI out of its minor groove and forms a complex with the dye itself (Kd determined by fluorescence titration ca. 3 mm, see the Supporting Information).41 D. J. Patel, A. Pardi, K. Itakura, Science 1982, 216, 581. This oligonucleotide is well-studied; it represents perfect B-DNA and all NMR signals can be assigned.42 A kink in the titration curve above stoichiometric DNA concentrations indicates formation of higher aggregates.43 M. H. Hou, S. B. Lin, J. M. P. Yuann, W. C. Lin, A. H. J. Wang