真菌Marasmiustricolor310b的培养特性及发酵产漆酶条件的优化论.doc

真菌Marasmius tricolor310b的培养特性及发酵产漆酶条件的优化 姬蓉蓉 （青海大学农牧学院草业科学系，青海西宁 810016） 摘要 以一株来自高寒草地土壤纤维素分解真菌Marasmius tricolor310b为研究对象，对其在不同温度、不同碳源、不同氮源、不同盐浓度、不同pH、不同盐离子等不同条件下培养，通过十字交叉法测定菌株直径，从而确定该菌株活性最大时的生物学特性;应用摇瓶液体发酵的方法，以秸秆粉为底物分别在不同培养条件下（温度、碳源、氮源、盐浓度、pH、盐离子），按照王剑锋等的方法进行测定其酶活的大小。经初步研究，结果表明菌株Marasmius tricolor310b在30、初始pH为4.8（偏酸性）、蔗糖为碳源、蛋白胨为氮源、盐浓度3时生长速度最快。 关键词：漆酶 ；真菌； 生物学特性 Rongrong-ji(Department of Grassland Science, Agriculture and Animal Husbandry College, Qinghai University, Qinghai Xining, 810016) Abstract In alpine meadow soil cellulose decomposition fungi strains from marasmius tricolor310b as the research object,in the different temperature,different carbon source ,nitrogen source,different salt concentration,pH，salt ions under different conditions,such as cultivating,strain diameter can be determined through cross the crossover,to determine the biological characteristics of the strain when the most reactive;shake bottle of liquid fermentation method,straw powder as substrate respectively in different culture conditions(temperature、concentration of carbon source、nitrogen source、nitrogen source、salt、pH、salt ions),according to the Jian-feng wang and other methods for determination of the size of the enzyme activity.A preliminary study,result show that the strain marasmius tricolor310b at 30 degrees,the initial pH 4.8 (partial acid),sucrose as carbon source and peptone and nitrogen source,grow fastest when salt concentration of 3 or less. Keywords:laccase;fungi;biological characteristics 目录1绪 论11.1 研究目的与意义11.2 国内外研究概况1 2研究内容与方法 2.1 实验材料. 2.1.1 实验菌株. 2.1.2实验用具.2.2培养基种类 2.3研究方法. 2.3.1生物学特性的研究方法. 2.3.2发酵产漆酶条件的优化.3结果与讨论 3.1 不同温度对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响 . 3.2不同碳源对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响. 3.3不同氮源对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响. 3.4不同pH对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响. 3.5不同盐浓度对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响. 3.6不同盐离子对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响. 3.7酶活的测定.4结果.参考文献.致谢.附件1外文文献.附件2中文翻译. 1绪论1.1 研究背景、意义和应用前景 漆酶，即对苯二酚，又名酚酶，多酚氧化酶等1 。漆酶是一种含铜的糖蛋白氧化酶，也称为多铜氧化酶，就功能而言，漆酶是木质素降解酶之一，就属性而言，它和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族2就功能而言，漆酶是木质素降解酶之一，与木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共同构成木质素降解酶系3。漆酶氧化木质素中的酚型单元形成苯氧自由基，从而导致木质素相关结构的降解和转化，在合适的氧化还原介体存在时，漆酶还可催化氧化非酚型的木质素模型化合物，由于天然来源的生物漆酶产量低、价格昂贵，很难满足市场需求，漆酶的规模化和产业化相应受到限制。 漆酶作为生物代谢产物，在生物体内参与应激防御反应、细胞壁重建、形态发生、与宿主相互作用、腐殖质的代谢更新等生物学功能,在体外漆酶可催化多种酚类和芳香胺类化合物的氧化，降解多环芳烃4，漆酶在木质素的生物降解有重要应用前景，除此之外漆酶被广泛应用于工业氧化处理过程中，例如各类漂白、生物去污、乙醇生产、生物传感器、生物燃料电池等5，在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域.人们对微生物在农业生态系统中的作用早有成熟的认识7。当前对土壤生态系统中微生物的研究逐步倾向于微生物和生态系统功能的相互关系, 与微生物及其多样性有关的生态系统功能的研究, 大多着眼于土壤生态系统中微生物的功能群, 研究微生物的功能已经成为微生物生态学中微生物多样性研究的又一新的研究领域8,9。因此, 以一株来自高寒草地土壤纤维素分解真菌为研究对象, 对其进行培养特性的研究, 旨在更好的了解其生物学特性和发酵条件, 以便更合理地开发和利用高寒草地土壤真菌产漆酶资源。1.2 国内外研究概况，发展趋势，立论依据 漆酶由首次在紫胶漆树的渗出液中发现的10，随后人们发现微生物（真菌、细菌）、动物、昆虫也能分泌这种酶。植物来源的漆酶主要出现在植物木质部，叶子、根中也有，植物漆酶主要参与愈伤组织形成、木质化等过程11，动物体中发现的漆酶很少，报道的有猪肾和麻蝇、烟草天蛾、绿头苍蝇、蚊子和双翅目的迁移类蝗虫等12-14。相对于植物和动物的真菌分泌物中都检测到了漆酶的活性15。近几年来，有关漆酶的研究在国际上越来越受到重视，据报道产漆酶真菌不下于1000多种，而且超过100 种真菌漆酶，已经从相应的培养物中被纯化，并对其理化特性做了深入研究主要集中于担子菌纲，子囊菌纲及半知菌纲等真菌，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。到目前为止，已有从土壤中分离筛选产漆酶真菌的报道16-19，茆摇婷等筛选出一株巨座壳科的真菌，通过多环芳烃污染土壤的生物修复试验中，发现筛选出的菌株可使土壤多环芳烃毒性当量大幅降低，认为筛选出的菌株适合修复PAHs污染土壤，潘澄等也从土壤中筛选出一株产漆酶真菌疣孢漆斑菌，证明该菌株在PAHs污染土壤修复中有一定的应用潜力。值得一提的是，真菌产漆酶具有以下几个优点：）真菌分泌的漆酶都是胞外酶，使得漆酶的分离纯化相比胞内酶而言稍显容易，而且在胞外的稳定性也较好；）产酶效率高，产生漆酶酶系结构较合理，相互间可发生强烈的协同作用；）可同时产生许多纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等，这些酶的协同效应对降解木质素具有重要的意义。由于漆酶巨大的应用价值，因此进行漆酶产生菌的生物学特性和发酵条件是非常有必要的。 2 研究内容与方法 一：材料与方法 1.1 实验材料与用具 1.1.1材料：一株来自高寒草地土壤纤维素分解真菌Marasmius tricolor310b 1.1.2用具：培养皿、锥形瓶、天平、培养箱、无菌操作台、烘箱、玻璃棒、量筒、 滤纸、容量瓶、直尺等。 1.2 培养基 1.2.1 菌株活化、保存培养基PDA培养基（英文名：Potato Dextrose Agar): 马铃薯200g、葡糖糖20g、琼脂10g、蒸馏水1000ML、pH自然，用于菌株的活化和复壮。 1.2.2 察氏培养基：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氢化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂15g、蒸馏水1000ML、pH自然，用于为该菌株提供不同培养条件。 1.3 研究方法 1.3.1 对真菌Marasmius tricolor310b培养特性的研究采用单因素实验设计，将活化后的菌株接种于不同温度、不同碳源、不同氮源、不同盐浓度、不同pH、不同盐离子种类的培养基上进行培养，以十字交叉法定期测量其直径，确定该菌株生长速度最快时的温度、碳源、氮源、盐浓度、pH、盐离子。 a温度对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响，主要分为5、10、15、20、25、30、35 七个梯度。 b 不同碳源对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响，主要为蔗糖、果糖、葡糖糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、木糖、肌醇、可溶性淀粉等(在30下进行）。 c不同氮源对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响，主要包括氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、尿素、丙苯氨酸、异亮氨酸等（在30下进行）。 d 不同pH对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响，主要包括4.8、 5.0、 5.4、6.8、7.0、7.4、8.0、8.4、9.18九个梯度（在30下进行）。 e不同的盐浓度对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响。主要包括0、1.5、3、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20十个梯度（在30下进行）。 f 不同盐离子对菌株活性的影响。主要包括铜离子、铁离子、铝离子、钾离子、锌离子、镁离子、钠离子、钙离子、钴离子等（在30下进行）1.3.2 发酵产漆酶条件的优化a:发酵方法：液体摇瓶发酵法b:产酶条件的研究 应用摇瓶液体发酵的方法，以秸秆粉为底物分别在不同培养条件下（温度、碳源、氮源、盐浓度、pH、盐离子）测定漆酶酶活力。C: 酶活力测定方法 以愈创木酚为漆酶底物，按照王剑锋等的方法进行测定,1个酶活单位（IU）定义为1min内氧化mol愈创木酚所需要的酶量。1.3.3数据处理 所有数据均用Microsoft Excle录入并作图，采用DPS.55进行数据分析。1.4 结果与分析 1.4.1 温度对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响 将菌株Marasmius tricolor310b接到PDA培养基上，每组三个重复，分别置于 不同温度的培养箱里，定时测定该菌株所形成的菌落的直径。 5 10 15 20 25 30 352014.11.90.60.62014.11.100.60.62.14.11.110.60.62014.11.120.60.62014.11.130.60.62014.11.140.60.62014.11.150.60.62014.11.160.60.62014.11.170.60.61014.11.180.60.62014.11.190.60.61014.11.200.60.6平均值生长速度与温 直径/cm 0 温度/结果表明，该菌株在温度10时均能生长，且温度为30时生长速度最快。1.4.2 不同碳源对菌株Marasmius tricolor310b活性的影响 将复壮后的该菌株接种于不同碳源的培养基上，每组三个重复，置于30的培养箱内，通过定期测定菌落直径的大小，确定对该菌株活性影响最大的碳源。shijian 直径 参考文献 1王镜岩，朱圣庚，徐长法生物化学（第三版上册）。北京：高等教育出版社，2002：428-429。2 Wan Y Y,Du Y M.Structure and catalytic mechanism of laccasesJ. 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