植物组织培养实验室的组成仪器设备及基本操作.ppt

第二章 植物组织培养实验室的组 成、仪器设备及基本操作 一、植物组织培养实验室的结构及设计要求： 完整的植物组织培养室通常包括洗涤室、化学实验室 、接种室、培养室、细胞学实验室等部分。可以根据实际 需要和条件进行设计。 但从功能上至少包括准备室（化学实验室）、接种室以 及培养室三部分，并且按顺序排列。 在化学实验室与接种 室之间应留有缓冲空间。 第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术 （一）准备室（化学实验室）： 1. 主要功能： 用于培养器皿的清洗、干燥、培养基 的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及 整理等工作。 2. 主要仪器设备及用品： 药品柜、实验台、水槽、超声波洗涤 仪、凉干架、干燥箱、各种玻璃器皿（ 烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、三角瓶 等）、蒸馏水制造装置。 天平、移液器、 pH计、水浴锅、微波 炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、及培 养基分装用品等、高压灭菌锅、 冰箱。 （二）接种室（无菌操作室）： 1、功能： 接种材料的灭菌、接种以及培养物的 继代转接等。 接种室要求保持洁净，与化学实验室 之间应设置缓冲室。 2、仪器设备及用品： 超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、 磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手 术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷 雾器、细菌过滤器等）等。 （三）培养室： 1、功能： 主要用于植物材料的培养。 要求室内洁净并能保持一定的温度 、光照以及湿度，以促进植物材料的 生长和分化。 2、仪器设备及用品： 培养架及灯管、摇床（振荡器 ）、空调、自动定时器、加湿及除 湿器、光照培养箱等。 （四）细胞学实验室： 1、功能： 主要用于培养材料的显微观察及 照相等。 2、仪式设备及用品： 体视显微镜、普通显微镜、倒 置显微镜、荧光显微镜、配套显 微照相装置、普通相机或数码相 机、切片机及配套制片及染色用 品等。 体视显微镜 用途：放大倍数580 倍主要用于植物形态 分化的观察、茎尖的 切取。 普通光学显微镜 用途：用于植物切 片观察，确定植物 的发育进程，如： 不定芽、不定胚的 分化过程以及其它 器官组织的分化等 。 倒置显微镜 用途：主要用于细 胞、原生质体的细 胞分裂和细胞团形 成的观察。 （一）洗涤： 1. 普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中 性洗涤剂洗涤。 2. 难清洗器皿及移液管等：用水清洗后 再用重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗， 或用超声波仪清洗。 重铬酸钾洗液的配制方法：43g重铬酸钾溶于 1000ml蒸馏水中，将浓硫酸缓慢倒入重铬酸钾 溶液中，浓度比例为1：1。 二、实验室基本操作： 1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。 （1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱 内，150 保温2小时，成本较高。 （2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 1520分钟 。 （3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入 95乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。 （二）灭菌： 灭菌 是指用物理和化学方法杀死物体表面和内 部的所有微生物（包括芽胞），使之呈无菌状态 。经过灭菌的物品称“无菌物品”。 2、培养基灭菌： 采用高压蒸汽灭菌。120 1520分 钟。 培养基体积越大，灭菌时间越长。 高温高压灭菌对培养基成分的影响： a.pH值普遍下降。 b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发 生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3 化合，就会产生磷酸钙沉淀。 c.不少培养基颜色加深。 d.体积和浓度有所变化。 e.营养成分有时受到破坏。 3、不耐高温材料的灭菌： 采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机 添加物等。 4、外植体的表面灭菌： 采用7075乙醇（10-30秒）、有效 氯1的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1 0.2%的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂中加 入几滴吐温20或80（Tween20或80） 效果较好。 （三）无菌操作： 1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸 或喷雾处理。接种前打开超净工作台及紫 外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气 体散出后开始操作。 2、保持超净工作台的洁净：接种前用70 乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前， 将手和手臂用70乙醇消毒，所需试验用 品用乙醇擦拭后放入超净工作台。 3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前 后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交 叉污染。 4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑 出，以减少污染源。 5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽， 出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。 第二章 植物组织培养实验室的组成、 仪器设备及基本操作 第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术 一、植物组织培养实验室的结构及设计要求 二、 实验室基本操作 第二章 植物组织培养实验室的组 成、仪器设备及基本操作 第二节 培养基的组成、配制与灭菌 一、培养基（medium）的组成和作用 通常植物组织培养所用培养基包括以下六大 类成分，即矿质营养、有机成分、植物生 长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等 。 培养基的主要指标是: 营养成分的浓度 植物生长调节物质的浓度 （一）矿质营养： 矿质营养又称无机营养，是指植物生 长发育所需要的各种化学元素。 矿质元素的生理作用： （1）组成各种化合物，成为结构物质 ； （2）许多酶和附酶的组成部分，参与 代谢； （3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷 平衡等电化学作用； （4）影响形态发生和组织、器官的建 成等。 根据植物对元素的吸收量，可以把植物必 需元素分为大量元素和微量元素。 国际植物生理学会规定植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5 mmol/l的元 素称为微量元素。 大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 分别占植物干重的百分数为18、10、70 、0.3%、0.07、0.3%、0.3 、0.07%、 0.05。 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、 Cl等。 1、大量元素： N、P、K、Ca、Mg、S等6种大量元素依靠各种无机 盐提供。 不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求 不同，需经试验确定。 目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。 其中以MS应用最广泛。 以MS为例6中矿质元素分别由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、 MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。 大量元素中的氮通常采用硝态氮 或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对 有些植物的培养物造成伤害，不适 宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸 、丝氨酸等来代替。 2、微量元素： 植物组织的对其需要量极少，过多会产生 毒害，如造成蛋白质变性、酶失活,代谢障碍 等。 各种微量元素均具有特定的生理功能，如 硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能 促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用 和呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。 微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿 素的合成起重要作用，由于在较高pH下 ，FeCl3极易形成Fe（OH）3沉淀，难以被 吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与 硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制 。 （二）有机成分： 主要包括各种维生素和氨基酸 常用的维生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、烟酸（ VB3）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等。 常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精 氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。 有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工 的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10 1000mg/L, 通常用于原生质体等培养。 此外肌醇是另外一种重要的有机成分，在维持离子平衡 ，糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及等生理 作用。它可以促进愈伤组织的形成，不定芽、不定胚的分化 。 （三）植物生长调节物质： 植物激素是植物代谢中产生的天然化合物，它 能直接影响植物细胞的分化、分裂以及影响植物的 形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、 萌发等生理活动。 在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长 调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控 。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、 根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。 常用的植物激素及生长调节物涉及五大 类植物激素： 1、生长素类： 2、细胞分裂类： 3、赤霉素类： 4、脱落酸： 5、多胺 6、乙烯： 1、生长素类： 组织培养中的功能是：促进细胞伸长 生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织， 促进生根。 常用的有NAA、IAA、IBA、2,4D等 。 2、细胞分裂素类： 功能：诱导芽的分化、促进侧芽 萌发；促进细胞分裂和扩大，促进茎 增粗，抑制茎伸长；延缓衰老。 常用细胞分裂素有BA、KT、ZT、 2ip等。 此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常 高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用 。 如TDZ，CPPU，4PU等。 3、赤霉素类： 主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无 效；对形成层细胞分化有影响，与生长 素协同作用；可以诱导离体成花；打破 休眠等功能。 常用GA3、GA4等。 4、脱落酸（ABA）： 促进休眠、衰老和脱落。组 织培养中较少使用，主要用于 种质资源的离体保存。 5、乙烯： 主要促进衰老和脱落，高浓度易形态 变化。 （四）碳源： 碳源主要为细胞提供合成新化合 物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底 物与能源，此外还能维持一定的渗透 压。 常用的碳源主要是蔗糖，使用浓 度在1050g/L，此外果糖、葡萄糖 、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性 淀粉等也常用于植物组织培养。 （五）琼脂： 琼脂作为固化剂用于组织培养 中，起支持植物的作用，不提供营 养，为海藻中提取的一种高分子化 合物，仅溶于热水（90 oC以上） ，成为凝胶，冷却后（40 oC以下 ）即凝固为凝胶。 琼脂的用量通常在410g/L。 （六）有机附加物： 1、椰子汁： 用量为100200g/L。 2、香蕉泥： 使用量为150200g/L。 3、苹果汁、番茄汁等。 （七）其他成分： 1、活性炭：使用量为0 .2-1%。 2、抗生素：常用青霉素、链霉素、 庆大霉素等，用量在520mg/L。 3、抑制酚类物质：抗坏血酸. 4、生长抑制剂： 常用矮壮素、比久（B9）、多效唑 （pp333） 、三碘苯甲酸、根皮酚等. 二、培养基的类型： 1、高盐浓度培养基：MS、B5、SH等。 适用于多数营养需求量较大的植物。 2、低盐培养基：WPM、 White、 Nitsh 等。 适用于木本植物的培养。 表1 MS培养基的组成配方 组成成分数量(mg/l)组成成分数量(mg/l) NH4NO31650 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 440 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5.8 KI0.83 肌醇 100.0 H3BO36.2 烟酸 0.5 MnSO44H2O22.3 盐酸吡哆醇 0.5 ZnSO47H2O8.6 甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2 O 0.25 盐酸硫铵等 0.4 CoCl26H2O0.025 表2 B5培养基的组成和配方 组成成分 数量(mg/l） 组成成分 数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5 KI 0.75 肌醇 100 H3BO4 3.0 烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO42H2 O 0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵 10 Na2-EDTA37.3 表3 N6培养基的组成和配方 组成成分 数量(mg/l)组成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185 蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O1.5 三、培养基母液及激素母液的配制： 由于培养基中元素用量少，种类多，因 此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分 配制成母液保存。 大量元素 微量元素 有机营养 激素 1、器皿和用具的准备 仪器包括万分之一天平，百分之一天平，pH计 用品包括不同型号的烧杯（2000ml、1000ml、 100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移 液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、试剂瓶若干（ 1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）、滴管 、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（150ml、100ml 、50ml）、培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸 、不同范围pH试纸、铅笔等。 玻璃器皿用前清洗干净。 2、药品及蒸馏水准备： 药品采用分析纯或化学纯试剂。 水利用蒸馏水或去离子水。 3、母液配制： （1）配制母液原则： 相同类型的试剂混合； 易形成沉淀的药品分开； 母液浓度要适宜； 用量要认真计算和核对； 药品要准确称量。 （2）MS培养基母液的配制： MS培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液 ，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（ 100或1000倍）、Fe盐（100倍）、有机物（100倍） 。 配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母 液试剂用量，然后称取药品，大量元素可以用百分 之一