冠心病患者辅助性T细胞亚群17的变化及意义.doc

KKME-专业医学搜索引擎/冠心病患者辅助性T细胞亚群17的变化及意义作者：赵朝1,2,苏莹3,程曼丽2,袁祖贻作者单位：. 西安交通大学医学院第一附属医院心内科，陕西西安710061;2. 西安市第一医院心内科，陕西西安710002;3. 西安市第八医院，陕西西安710061 【摘要】目的探讨不同类型冠心病患者外周血辅助性T细胞亚群17(Th17)的变化及临床意义。方法选取20例急性心肌梗死(AMI)患者、23例不稳定性心绞痛 (UA) 患者、19例稳定性心绞痛(SA)患者，另选22例同期住院的非冠心病患者作为对照组。采用流式细胞术检测外周血Th17细胞的百分率;实时定量PCR检测相关基因IL-17A、RORt和STAT3 mRNA的表达;ELISA法检测血浆IL-17A的浓度。结果UA患者和AMI患者外周血中Th17细胞的百分率显著高于SA患者和对照组(P0.01);与SA组患者和对照组相比，UA组和AMI组患者Th17细胞相关基因IL-17A、RORt和STAT3的mRNA表达显著增高或有增高趋势。结论UA患者和AMI患者外周血中Th17细胞激活，Th17激活可能与斑块的不稳定密切相关。 【关键词】 动脉粥样硬化,辅助性T细胞亚群17(Th17),冠心病,炎症,IL-17A;RORt;STAT3 ABSTRACT： ObjectiveTo explore the significance and changes of T helper 17 (Th17) cell in different types of coronary artery disease. MethodsWe recruited 20 patients with acute myocardial infarction (AMI)， 23 patients with unstable angina (UA)， 19 patients with stable angina (SA) and 22 control subjects without coronary artery disease. The percentage of Th17 cell， plasma IL-17A and mRNA expression of related genes (IL-17A， RORt and STAT3) in these patients were measured by flow cytometry， ELISA and real-time quantitative PCR， respectively. Results The percentage of Th17 cell increased significantly in AMI and UA patients compared with that in SA group and controls (P50%;SA诊断标准：典型的劳力性心绞痛并伴有运动试验中心电图ST段压低1 mm，冠状动脉造影至少有1支血管直径狭窄50%。对照组为年龄和性别匹配的同期经冠脉造影及临床症状排除冠心病的住院患者。排除标准：6个月以内的心肌梗死、发病到抽血时间24 h、心房颤动、心瓣膜病、急性炎症反应、自身免疫性疾病、肝肾疾病、血液系统疾病及服用免疫抑制剂者。 1.2方法 1.2.1主要试剂及仪器 佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)购自Calbiochem公司;多甲藻叶绿素蛋白(Percp)标记的CD4单克隆抗体、藻红蛋白(PE)标记的IL-17A单克隆抗体、同型对照抗体、莫能霉素(monensin)和FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司);RPMI1640培养液购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季清公司;总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司;DNA荧光染料(SYBR Green)购自TaKaRa公司;引物由TaKaRa公司设计和合成;IL-17A的ELISA检测试剂盒购自上海ExCell公司。 1.2.2常规检查 血脂、血糖、心肌酶和肌钙蛋白由西安交通大学医学院第一附属医院生化室完成。 1.2.3人外周血单个核细胞的分离 入院第2天清晨患者空腹平卧位采集肘静脉血5 mL(症状发作到抽血时限24 h)，肝素抗凝，3 000 r/min离心15 min分离血浆，贮存于-80 冰箱中，用于检测血浆细胞因子的浓度。Ficoll密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(PBMC)。 1.2.4流式细胞术检测Th17细胞的百分率 用3 mL含有胎牛血清的RPMI1640培养液重悬PBMC，加入刺激剂佛波酯(50 g/L)、离子霉素(500 g/L)和莫能霉素(0.67 mL/L)，在37 、50 mL/L CO2孵箱中培养4 h，PBS液洗1遍，将细胞密度调整为2106/mL;加入CD4-Percp抗体，4 孵育30 min，PBS液洗1次;加入250 L固定/破膜液，4 孵育20 min，用1 mL破膜/洗液洗涤2次，平均分为2管;分别加入IL-17-PE和同型对照抗体，室温避光孵育30 min，破膜/洗液洗2次;流式细胞仪检测。用前向散射光(FSC)及侧向散射光(SSC)圈出淋巴细胞，以CD4+细胞设门，每一样品检测1104个细胞。 1.2.5实时定量PCR检测IL-17A、RORt、STAT3 mRNA的表达 按照试剂盒说明，用Trizol试剂裂解PBMC提取总RNA，逆转录为cDNA。采用SYBGreen染料法检测IL-17A、RORt和STAT3 mRNA的表达。引物由TaKaRa公司设计和合成，扩增引物序列分别为：IL-17A正义引物：5-CAATCCCACGAAATCCGAGATG -3，反义引物5-GGTGGAGATTCCAAGGTGAGG-3;RORt：正义引物5-GCTGTGATCTTGCCCAGAACC-3，反义引物5-CTGCCCATCATTGCTGTTAATCC-3;STAT3：正义引物5-TGCCTTATCAGGGCTGGGATAC-3，反义引物5-GGGACCTTTAGACACGCAAGGA-3;GAPDH：正义引物5-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3，反义引物5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。配制20 L反应体系，在IQ5型荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为：95 预变性10 s,95 5 s,61 15 s,72 10 s，共45个循环，结果以GAPDH为管家基因，2-CT计算mRNA的相对表达。 1.2.6ELISA法检测血清IL-17A的浓度 应用ELISA试剂盒进行检测，酶标仪测在450 nm波长处的吸光度值，IL-17A的灵敏度为4 ng/L。 1.3统计学分析 采用SPSS11.5软件进行统计分析。CK-MB、TnI用四分位数间距表示，患者的基本情况、生化指标和细胞百分率以均数标准差(x-s)表示。CK-MB、TnI和mRNA水平不符合正态分布，用Mann-Whitney U检验，组间的比较用Bonferroni 法调整检验水准。患者的一般资料和细胞百分率符合正态分布，采用方差分析(ANOVA)，方差齐的数据采用S-N-K检验，不齐的用Games-Howell检验。P0.05)，AMI组的CK-MB、TnI较其余3组均显著升高(P0.01，表1)。表1各组患者的一般情况和生化指标的比较 2.2各组患者Th17细胞百分率的比较 UA组和AMI组患者Th17(IL-17A/CD4+T)细胞的百分率分别为(1.680.52)%和(1.700.61)%，较SA组的(1.000.33)%和对照组的(0.970.31)%明显升高(P0.01，图1)，而UA组和AMI组、SA组和对照组的两两比较，差异均无统计学差异。图1UA组和AMI组外周血Th17细胞的百分率明显升高A：各组患者CD4+IL-17A+细胞占CD4+T细胞百分率的流式细胞图(各1例，以CD4+细胞为例);B：各组患者Th17细胞百分率的比较，与对照组和SA组比较，*P0.01。 2.3各组患者Th17细胞相关基因mRNA表达的比较 与对照组比较，AMI组患者Th17细胞相关基因IL-17A、RORt和STAT3 mRNA表达均显著升高(P0.01);与对照组比较，UA组患者IL-17A和STAT3 mRNA表达显著升高(P0.01)，而RORt仅有增高的趋势(P=0.05)。与SA组比较，AMI组患者IL-17A和RORt mRNA表达显著升高(P0.01)，而STAT3 mRNA表达仅有增高趋势(P=0.054);与SA组比较，UA组患者IL-17A、RORt和STAT3 mRNA表达虽有增高趋势，但均无统计学差异(图2)。 2.4各组患者血浆IL-17A浓度的检测情况 血浆IL-17A浓度在对照组和SA组仅有1例可检测出，在UA组和AMI组分别有3和2例检测到，其余均低于试剂盒的最低检测水平而未能检测。因此，我们不便比较各组血浆IL-17A的浓度。图2各组患者Th17细胞相关基因mRNA表达的比较 3讨论 在不同类型的冠心病中，急性冠脉综合征(ACS)是其中非常严重的类型。ACS包括不稳定性心绞痛和急性心肌梗死，是由于不稳定的AS斑块破溃和斑块内出血，继发血栓形成，导致冠脉管腔完全或不完全阻塞引起。在不稳定斑块的破溃中，免疫细胞尤其是T淋巴细胞起着重要的作用5-6。传统观点认为，辅助性T细胞亚群1(Th1)促进AS斑块破裂7，而调节性T细胞(Treg)可能使斑块更趋于稳定8。 近年来发现的Th17细胞是一种新的CD4+T细胞亚型，主要分泌IL-17A等细胞因子，RORt和STAT3是Th17细胞分化和分泌IL-17A的关键核转录因子。Th17细胞在多种自身免疫疾病如EAE、类风湿性关节炎和炎症性肠病的发生中起着至关重要的作用。而在AS的发生发展中，多数研究表明IL-17A促进了AS的发生9-10，但亦有研究表明IL-17A可能对AS起保护作用11。为进一步明确Th17细胞在AS中的作用，本实验通过细胞内染色检测外周血循环中Th17细胞的百分率。结果显示，UA患者和AMI患者中Th17细胞的百分率较SA组和对照组患者显著增高;同时本研究还通过实时定量PCR检测4组患者PBMC的Th17细胞相关基因mRNA的表达，结果显示，Th17细胞相关的IL-17A、RORt和STAT3的mRNA表达在UA患者和AMI中明显升高或有增高趋势，提示UA和AMI患者存在Th17细胞激活。Th17细胞和斑块不稳定的关系目前仍不明确。PEJNOVIC等12研究表明，在apoE基因敲除小鼠合并IL-18功能缺陷时，AS斑块的面积显著增加，且增加程度和Th17细胞数量增加密切相关;另外斑块内的巨噬细胞亦增加，纤维帽变薄。提示Th17细胞和斑块不稳定密切相关。此外，离体培养观察到IL-17A促进了血管平滑肌细胞的基质金属蛋白酶(MMP)和组织因子的分泌，上调了粘附分子ICAM-1、VCAM-1以及趋化因子等的表达。上述因素都会促进稳定斑块进展为不稳定斑块，有助于诱发UA和AMI的发生。 本研究中，我们仅在少数患者血浆中检测到IL-17A。因此，不便比较血浆的IL-17A的浓度。这与EID等13的研究结果相符。EID等13研究还发现，在AS的组织培养中，在抗CD3和CD28抗体或佛波酯和离子霉素的刺激下，上清液中IL-17A的浓度显著增加，而无AS的组织培养中的IL-17A不增加。此外，ERBEL等9发现，在apoE基因敲除小鼠使用抗IL-17A克隆抗体能显著减少AS斑块的面积，增加纤维帽中的胶原含量，减少了纤维帽中T细胞和巨噬细胞的浸润，使斑块趋于稳定，不易发生破溃。据此我们推测本研究血浆中IL-17A不易检测的可能的原因为：尽管在斑块中的Th17细胞和IL-17A高表达，但血清中的IL-17A不能反映斑块中的水平;血清中的IL-17A本身很低不易检测;作为一种细胞因子，IL-17A的半衰期很短。尽管我们不便比较血浆的IL-17A的浓度，但UA患者和AMI患者中Th17细胞的百分率和Th17细胞相关基因的mRNA表达明显增高，提示UA和AMI中存在Th17细胞的激活，全身或局部炎症反应加剧。C反应蛋白和高敏C反应蛋白(CRP，hsCRP)是反映UA和AMI患者体内炎症反应水平的指标。该项研究将另文发表。 本研究的不足之处在于仅对不同类型冠心病患者Th17细胞的百分率、相关基因mRNA的表达以及血浆IL-17A进行检测，尚未涉及到Th17细胞和IL-17A诱导慢性炎性反应及促进斑块不稳定的机制。 综上所述，UA和AMI患者存在Th17细胞功能激活，这可能加剧了机体的全身以及斑块局部炎症反应，使斑块的纤维帽变薄，易于破溃，从而诱发了UA和AMI的发生。 【参考文献】 1ZHU JF， PAUL WE. 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