[基础科学]高效液相色谱仪的管理与维护.doc

高效液相色谱仪的管理与维护1引言高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器以及功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于生物医药研究、环境监测和食品检测等领域。我们在应用先进的HPLC技术进行各种科研工作中，为保证分析结果的科学性和准确性，必须重视和加强对液相色谱仪的管理和维护。只有良好规范的管理(GLp)，才能使仪器处于最佳工作状态，保证各项分析工作顺利完成，得出的实验数据才最真实可靠。我们希望通过本文的技术交流，能使广大液相色谱工作者不仅掌握液相色谱技术，还能管理和维护好液相色谱仪。2 液相色谱仪流路泵系统的管理与维护 液相色谱仪的流路系统主要是由输液泵和连接管道组成。输液泵的主要作用是把流动相和样品带人色谱柱中，使样品在色谱柱固定相和流动相之间作用并实现分离。因此，正确配制流动相，维护好泵体和连接管路，对保证输液泵的流量精度和保留时间(tR)的重复性十分重要。2.1流动相的配制和准备2.1.1溶剂的纯化 在高效液相色谱分析中，正相色谱以已烷作为流动相的主体，二氯甲烷、氯仿、乙醚作为改性剂;反相色谱以水作为主体，以甲醇、乙睛、四氢吠喃作为改性剂。HPLC分析均应使用HPLC级纯度的溶剂，AR级的溶剂可能会由于杂质的存在而出现鬼峰。 正相色谱分析中使用的己烷、二氯甲烷、氯仿、乙醚中经常含有微量的水分，这会改变液固色谱柱的分离性能，使用前应用球形分子筛柱脱去水分。反相色谱分析中使用的甲醇、乙睛、四氢吠喃，不必脱除微量水，但甲醇、乙睛等使用前最好经硅胶柱净化，去除具有紫外吸收的杂质。 要保证配制流动相用水的纯度足够高。由于去离子水通常含有一些有机物，所以不适合用于HPLc分析用，最好使用超纯水(电阻率18Mfl.cm)。如果条件有限，可将去离子水再次蒸馏，现用现蒸，保持新鲜，还能脱去CO:，使用效果也不错。2.1.2缓冲溶液 有些分析需要用到缓冲盐的流动相，配制时盐试剂要用AR级以上、没有污染、过期;现用现配，不要储存时间过长，避免pH值发生变化和成分分解，影响色谱分离的效果。缓冲盐的流动相最好能在实验室自己配制，商品化的流动相可能会添加有硫代硫酸钠稳定剂，会影响缓冲液的光学和色谱性能。2.1.3过滤 无论是有机水溶液还是缓冲盐溶液的流动相，配好后都要通过0.45卜m滤膜过滤后再上机使用，这样能够有效防止由于微粒的存在使流路管道堵塞。过滤后应把溶剂放在密闭容器中，以防止被重新污染。过滤后的溶液既可用于色谱分析，也可用于清洗诸如泵头、柱塞杆、单向阀和密封圈等仪器部件，保持输液泵的性能良好。2.1.4脱气 所有的流动相在进人HPLC系统之前都应该首先脱气(即使仪器上有在线脱气)，因为没有脱气的流动相进人到高压系统后，存在的气泡会导致系统的流速和压力不稳定，出现鬼峰等间题。从溶液中排除气泡的方法主要有:真空脱气、氦气脱气和超声波脱气实际工作中真空抽滤的方法很有效，它既能脱气又能过滤，但必须在上机前完成。在线连续脱气可以防止气体随温度的变化重新溶解在溶剂中。2.1.5流动相的化学特性 流动相一般不要使用强酸或强碱溶液。因为pH值过高或过低会损坏输液泵中的密封圈和柱塞杆，除非流路需要钝化(用Zm心L的硝酸溶液)，也应用后立即用纯水冲净。 在使用含水较高的流动相时，应注意不同色谱柱使用方面的限制，因为传统的烷基键合固定相在有机溶剂含量低于5%的流动相中容易发生碳链断裂一些新型键合固定相可以在纯水为流动相的条件下使用。2.2系统管路和连接2.2.1管路 根据承受压力的大小和流动相、样品性质的差异，液相色谱仪需采用不同材质的管路，常有不锈钢管和聚四氟已烯管。管路材质选择不当将导致谱带展宽，甚至引起样品变性，直接影响到分析结果。不锈钢管耐腐蚀，一般用于有高压的部分，即连接从泵出口到检测器人口段处，使用前应先经甲醇*水*硝酸溶液处理;塑料聚和物管柔韧性好，化学惰性强，多用于从储液器到泵、检测器出口和泄液阀出口，使用前应先用甲醇冲洗即可。另外，流路管线应保持通畅，不要存在硬性弯曲部分。2.2.2连接 理想的HPLC系统应是死体积最小、密封性好不漏液。为减少死体积，降低柱外效应(会使色谱峰展宽)，从进样器到柱及柱到检测器之间，应尽可能采用较短且较细内径的连接管。此外，采用较大内径、较长的色谱柱时，柱内峰展宽较大。对于其它位置连接管的长度和直径要求不十分严格，只要在换溶剂时达到快速、干净的目的即可。管路选择的基本原则为有样品通过的管路内径要细，而排放用的管路可以稍粗。3 色谱分离柱的使用与维护 色谱柱是高效液相色谱仪实现分离过程的核心部件，使用和维护好色谱柱是保持柱效、延长柱寿命的重要措施。色谱分析中具备稳定高效的色谱柱和固定相是建立适合范围广、重现性理想的分析方法的基本保证。色谱柱在使用过程中常出现的问题主要涉及到:色谱柱的寿命、保留时间与分离度的重现性色谱峰脱尾等方面。3.1色谱柱的使用寿命 色谱柱使用过程中，会由于各种原因导致分离失败或色谱柱失效，主要表现有:色谱柱反压增高、峰脱尾、塔板数下降、保留值降低等。造成这些问题的原因主要有柱滤板问题、强保留组份影响和化学影响等，下面将分别讨论:3，1.，色谱柱筛板问题及对策 色谱柱人口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一，筛板堵塞会导致柱压升高，色谱峰脱尾、塔板数降低。注射样品中含有微粒杂质，最有可能堵塞色谱柱人口，降低柱寿命，故要在注样前，将样品过滤或离心;进样器与泵密封垫的磨损也会带来微粒，故可在进样阀与色谱柱之间用在线过滤器，常可避免色谱柱滤板堵塞问题。当筛板部分堵塞或进口处填料塌陷形成异常峰形时，可用强溶剂反冲色谱柱(低速)。如不见效，则需更换筛板，或重新填补填料后更换筛板3.1.2强保留样品组份影响及控制 强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地缩短色谱柱寿命，在分析生物体液时尤为突出。这时，可在色谱柱加一保护柱，能够有效减少强吸附组分的污染。保护柱(预柱)是内装填料与分离柱性质相近的短柱，接在分离柱之前，可代替流路过滤器。保护柱的作用是吸附强保留组分，收集和阻塞化学垃圾进人分离柱，这些垃圾如果直接进人分离柱会逐渐堆积在柱头，最终降低柱效能。保护柱是消耗品，如分析血浆样品，一般分析50个样品后需更换新柱芯。另外，每次分析结束后可用强溶剂冲洗分离柱(应卸下保护柱)，以除去可能吸附在分离柱柱头的污物，有效延长色谱柱的使用寿命。3.1.3化学影响 在分离过程中色谱柱固定相的流失会显著降低柱的使用寿命，应避免使用对固定相侵蚀性强的固定/流动相组合。短链硅烷基基团反相柱稳定性最差在低pH条件下可很快流失有机相，而长链烷基反相柱(C18、CS)较稳定。 我们应合理选择分离柱。选择色谱分离柱主要根据两点，一是根据待测组分的分子量的大小，二是根据流动相条件，包括pH值、离子强度和溶剂极性等。完全经化的硅胶基质的键合相柱，其表面的硅经基分布均匀单一，稳定性好，通常要求流动相pH值在3一7之间，极端pH值(8)的流动相会溶解硅胶，使键合相流失。而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料(如Waters公司的XTer-ra色谱柱)，集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅经基，使这种新型填料具有分辨率高稳定性强、pH范围宽(1一12)的优势，其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。所以一定要根据分析的对象、流动相的条件选择合适的分离柱，茫然时可向公司的技术人员咨询。3.2保留时间与色谱柱选择性的关系 由于色谱柱不同硅胶基质的物理化学性质存在差异，如比表面积、孔径、纯度等，以及键合相存在交联与非交联、密度和封尾程度的差异，会使官能团相同(C18、cs)，键合相不同的色谱柱的保留值发生变化。硅胶基质表面积增加，则有机固定相的量也增加，使保留值提高;非交联型键合固定相色谱柱的重现性好于交联型键合固定相色谱柱;致密键合填料比低硅烷浓度键合相的重现性好，也更稳定;硅烷化条件的不同也会导致不同品牌键合相之间保留行为的不同。3.3色谱分离条件与保留值的关系 在实际分析过程中，除了色谱柱不重复带来的问题外，流动相、流速、进样量、温度等因素均会带来色谱柱分离性能的差异。如缓冲液的选择和配制不正确，导致保留值重现性不好，流速的变化、基线漂移、柱反压波动大，对色谱柱的性能均有影响。进样量过大能引起柱超载，使峰的保留时间降低，一般内径约4.6mm色谱柱的进样量为ro一50林9。当使用自动进样时，应保持环境温度的恒定，避免柱温的波动，引起保留时间的不稳定。色谱柱在使用过程中，保留时间和分离度会随使用时间的延长而逐渐降低，可通过调整流动相的溶剂强度恢复分离。3.4谱峰脱尾及处理办法 色谱分析中经常见到色谱峰脱尾现象，特别是用过的柱子，其原因主要是:柱效下降、筛板堵塞、床体塌陷、柱头污染、进样超载、流动相不匹配、柱外效应等。为防止柱头堵塞污染，使用中最好加保护柱，如果柱头被污染，可用强溶剂反冲色谱柱，会恢复一定的柱效。样品最好用流动相稀释，防止谱峰变形、样品沉淀和大溶剂峰。与高效液相色谱仪有关的柱外效应，如:流路的管线过长、检测器流通池的体积过大，也会使峰性脱尾，应尽量选择细内径的短连接管、小体积检测池。另外，流动相中加人三乙胺等改善剂可消除流动相，固定相与样品之间的不匹配，改善峰型。3.5日常工作中怎样维护好色谱分离柱 1)及时冲洗分离柱。每次分析工作结束时，先用水冲洗缓冲盐，然后后要过度到用强溶剂冲洗柱子，如:可用色谱纯甲醇、乙腊冲洗反相Cl:柱，目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇/水为流动相也应这样冲洗柱子，在一定程度上可恢复柱效;平时不做分析时也要定期冲洗和再生柱子。 2)做好样品纯化，最大限度减少柱的污染。我们在多年的分析工作中发现，凡是样品纯化的越干净，分离柱的寿命就越长;反之，只是提取没有纯化的样品，分离柱柱效下降较快。建立一个理想的色谱分析方法应该有一套有效的样品前处理方法，特别是在分析血浆和尿液样品时，要特别注意样品的提取与纯化，尽量使处理过的样品中杂质(如大分子蛋白、有机物等)降到最低，保护柱头和柱子。 3)提取纯化好的样品最好用流动相来溶解，一方面减少色谱图中的溶剂峰干扰，另一方面也是检查样品在流动相中的溶解性，如果样品进样后在流动相中沉淀，会堵塞进样器和柱头，甚至样品分解，出现怪峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件，如更换样品溶剂，或改进处理样品的方法，或过滤，去除不溶性物质。4 几种检测器的管理与维护 作为液相色谱仪的三大关键部件(输液泵、色谱柱、检测器)之一的检测器，主要用于监测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，将样品组成和含量变化转化为可供检测的信号，完成定性、定量分析。常用的检测器主要有紫外吸收检测器(UVD)、荧光检测器(FLD)和电化学检测器等。4.1紫外检测器 使用紫外检测器时要注意环境因素带来的干扰由于静电的作用，检测器在使用时易于从周围环境中吸附尘埃，覆盖在光学元件上的尘埃能降低光的传播效率，加大了光的散射，对检测不利。故紫外检测器周围的环境要清洁，经常打扫，保持干净。强紫外照射还会使一些光学材料涂层降解，慢慢增加噪声，故检测器应避免阳光直射。同时，要远离热源、暖气管道等。 检测器产生噪音的来源主要是由于池内气泡和灯的寿命，其中检测池内气泡的存在是产生噪声的主要来源。为减少气泡的产生，应使流动相充分脱气或提高检测池压力(在检测器出口设置限制器保持一定的反压)。长时间不用检测器时，应定期冲洗流路赶走池内产生的气泡。使用氛灯作光源时，由于随时间的延长，氖灯光强降低、噪声会不断加大，故检测器要用时再打开，用完尽快关闭，延长氖灯的使用寿命。4.2荧光检测器的使用与维护 荧光检测器的灵敏度比紫外吸收检测器高100倍，当要对痕量组分进行选择性检测时，它是一种有力的检测工具。使用中应注意以下几点: 1)测定中不能使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂作流动相仁。 2)溶剂的极性和溶液的温度对荧光强度有明显的影响。增大溶剂的极性，可导致荧光增强。通常荧光物质溶液的荧光效率和荧光强度，随着温度的升高而降低，故在液相色谱分析中，荧光检测器通常在室温下操作，以保证足够的灵敏度。 3)当样品浓度过高时，荧光物质分子易与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起溶液的荧光强度降低，是荧光强度不再与浓度呈线性关系，即荧光碎灭效应。因此，在进行荧光检测时，样品要配成低于1ug/mL浓度的样品。4.3安培电化学检测器的管理与维护 电化学检测器具有较高的灵敏度高和较强的选择。其最低检测限可达ro一9一10一29;由于只对电活性物质有响应，不受非电活性物质的干扰，因此有较强的选择性。由于电极精密易损，使用时要十分仔细和爱惜，对仪器的管理与维护就更加重要。 1)工作电极的保护:工作电极表面在测定完样品后容易被污染，需要经常进行清洗甚至抛光，以保持电极表面的光洁度，从而来保证检测器的灵敏度。清洁工作电极的方法有化学法和物理抛光法。 2)气泡的影响:工作电极在分析时对流路中的气泡非常敏感，如有气泡存在，不仅基线会出现噪音尖峰，还会影响信号的采集。故使用安培检测器时，配制流动相的水要新鲜，充分脱气，以消除流路中气泡的干扰。 3)金属离子的影响:如果使用的是不锈钢材料的输液泵和金属连接管道，可先用ZmoFLHNO。溶液钝化系统(注意要断开分离柱)，以减少金属离子的干扰，减少平衡时间，还可在流动相中加EDTA 隐蔽剂。 4)对流动相的要求:用于安培电化学检测器的流动相中必须含0.01一0.lm0FL的电解质(如含盐的缓冲溶液)，以确保流动相具有导电能力，因此，以水溶液为流动相的反相色谱及离子色谱大多适合于安培检测器。 5)专用性:安培检电化学测器对仪器系统、流动相的流速、柱温、pH等因素变化较敏感，使用时最好专用一套液相色谱仪，减少外界的干扰，流动相的组成和分析方法保持稳定。5 液相色谱仪对环境的要求和日常维护5.，仪器的环境要求 液相色谱仪和大多数分析仪器一样，对仪器周围的环境有一定的要求，但没有太特殊的的要求，满足一般分析仪器室的基本条件，就能保证仪器的稳定运行和安全操作。 1)照明:室内照明要光线适中，避免阳光直射。为避开直射光线对仪器操作、观测的影响，仪器(显示屏)应侧向光线。实验室窗户要挂窗帘，以便随时调节光照强度。 2)通风:使用液相色谱仪分析过程中，由于流动相中含有挥发性有机溶剂(甲醇、乙睛等)会产生有害气体，对仪器中的光学元件带来腐蚀，应注意仪器室的通风，以排除室内有害气体、保持空气清新。通风主要有两种方式:一种自然通风，定时打开门窗，让内外空气对流;另一种是强制通风，如用通风柜、排风扇等，及时将有害气体排出室外。 3)环境温度和湿度:适宜的温度和湿度是保障HPLC仪正常运行、性能稳定的必要条件。HPLC 仪一般要求室温在20一30之间，日温度变化2一3，不要波动太大，否则，在开机分析时会影响色谱分离;夏季一定要控制室温不要超过30，温度太高会使流路系统产生气泡，影响检测器的正常工作(如荧光检测器)。室内相对湿度应控制在60%以下。 4)供电:液相色谱室应设有照明电源和动力电源，动力电可供仪器运行使用。为减少噪音的干扰，仪器应远离瞬时供电的大功