冬虫夏草液体发酵产胞外多糖的研究.docx

冬虫夏草液体发酵产胞外多糖的研究全卫丰汪洁杜姝莲刘广建( 江苏省微生物研究所有限责任公司 无锡214063)摘 要: 本文以冬虫夏草菌丝体产胞外多糖为参考指标, 对冬虫夏草液体发酵所采用的培养基成分 和 发 酵 条 件 进 行 了 研 究 , 确 定 了 培 养 基 的 合 理 配 比 为 蔗 糖3% 、 玉 米 粉5% 、 豆 饼 粉4% 、mgso4.7h2o0.05%、kh2po40.1%、vbi0.01%, 22、ph6.5, 120转/min摇床, 摇瓶培养7天, 冬虫夏草胞外粗多糖产 量为5.86g/l。关键词: 冬虫夏草; 液体发酵条件; 培养基; 虫草多糖。冬虫夏草(cordyceps4sinecsis)是球壳目、麦角菌科、虫草属的虫生真菌, 其有效成分虫草多糖具 有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗放射、保护肾脏等作用1, 由于野生的冬虫夏草生长条件要求 严格, 对寄主的选择性强, 目前还不能实现人工栽培, 因此用深层液体发酵冬虫夏草菌丝体从中提取 虫草多糖具有广阔的应用发展前景。体, 二者合并, 4000r /min离心15min。取上清液, 在旋转蒸发仪上浓缩至30ml, 用三倍体积的95%乙 醇沉淀, 收集沉淀, 用苯酚- 硫酸法测定其中的多 糖含量2。22.1结果与分析发酵培养基优化在液体发酵基本培养基中, 以a蔗糖、b玉米1材料与方法粉、c豆饼粉为三组试验因素, 每组试验因素取三个水平3, 蔗糖1%、3%、5%, 玉米粉1%、3%、5%, 豆饼粉2% 、4% 、6% , 采用l9 ( 34) 正交表进行正交 试验, 初始ph6.2, 液体发酵结果见表1。表1、 三组试验因素正交试验对虫草多糖产量 积累的影响1.1 供试菌种: 冬虫夏草1号, 由本所保藏。l.2 培养基斜面培养基(pda培养基): 马铃薯汁20% 、琼脂2% 、葡 萄 糖5% 、mgso4.7h2o0.05%、kh2po40.1%、ph自然。种 子 培 养 基 : nh4no302% 、 葡 萄 糖0 .5% 、 kh2po40.1%、mgso4.7h2o0.05%、ph自然。液体发 酵基本培养基: mgso47h2o0.05% 、kh2po40.1% 、 vbi0.01%, 初始ph6.5。1.3菌种活化将保藏菌 种 冬 虫 夏 草1 号 接 种 于pda斜 面 ,20培养14d左右, 将pda斜面菌种接种于种子培养基中, 22、120转 /min旋转式摇床培养7d。摇瓶发酵培养条件以5%的接种量转接于实验规定的发酵培养基100ml中, 置于旋转式摇床, 120转 /min, 20培养7d。1.41.5胞外粗多糖含量测定用多层洁净纱布过滤发酵液, 净水洗涤菌丝3试验12345因素粗多糖(g/l)a蔗糖(%)b玉米粉(%)c豆饼粉(%)1(1.0)1(1.0)1(1.0)2(3.0)2(3.0)1( 1.0)2(3.0)3(5.0)1(1.0)2(3.0)1(2.0)2(4.0)3(6.0)2(4.0)3(6.0)4.294.734.454.484.6167892(3.0)3(j.0)3(5.0)3(5.0)3(5.0)1(1.0)2(3.0)3(5.0)1(2.0)3(6.0)1(2.0)2(4.0)5.234.323.964.52k1k2k3k1k2kr13.4714.3212.84.494.774.270.513.0913.314.24.364.434.730.3713.4813.7313.384.494.584.460.12图 1、ph值对粗多糖产量的影响图 2、温度对粗多糖产量的影响图 3、培养时间对粗多糖产量的影响第 36 卷第 3 期2007 年 6 月发 酵 科技 通 讯从表1中可看出, 三组不同成分的碳源和氮源因素不同水平间的组合对粗多糖的产量影响差异较大, 由极差r值可知三个因素对粗多糖产量的影响表4不同培养温度对胞外粗多糖产量的影响培养温度18202224 26粗多糖产量( g/l)4.795.415.684.854.26程度大小依次为abc,即蔗糖对粗多糖产量的影2.2.3摇瓶不同培养时间对粗多糖产量的影响响最大, 玉米粉次之, 豆饼粉对粗多糖产量的影响最小。从表1实验结果中可以看出a2b3c1组合其相应的 粗多糖产量最高, 达到5.23g/l, 由k值可知, 最优组合 应为a2b3c2, 进一步对两组合进行比较试验, 每个组 合的试验均做三次重复, 试验结果见表2。表2 a2b3c1与a2b3c2组合对胞外粗多糖产量的影响以5%的接种量接种种子液于发酵培养基中, 在ph6.5, 培养温度为22条件下, 分别培养1、3、5、7、9 天。每个培养时间做3个摇瓶, 22, 120转/min摇床 培养, 测定发酵液中粗多糖含量。结果见表5、图3。表5不同培养时间对胞外粗多糖产量的影响 培养时间( 天)13579粗多糖产量( g/l)0.653.144.985.725.05 不同发酵条件对冬虫夏草胞外粗多糖产量的影响见图 1、图 2、图 3。由表2 结果可以知道, 采用a2b3c2 组合, 发酵结果产生的粗多糖含量较高, 为5.43g/l, 因此采用 a2b3c2 组 合 , 即 蔗 糖3% 、玉 米 粉5% 、豆 饼 粉4% , mgso4.7h2o0.05%、kh2po40.1%、vb10.01%。2.2不同液体发酵条件对虫草多糖产生的影响为了考察菌体在不同ph值, 不同培养温度,不同培养时间对虫草多糖积累的影响采用优选出的培养基配方1 进行不同液体发酵条件的研究。( 即 蔗 糖 3% 、 玉 米 粉 5% 、 豆 饼 粉 4% 、mgso4.7h2o0.05%、kh2po40.1%、vbl0.01%)。2.2.1ph值对胞外粗多糖产量的影响以0.1m磷酸缓冲液调节培养基ph, 以灭菌后 实测的ph为准。蔗糖与培养基分开灭菌。以优化 的发酵培养基配方进行摇瓶试验, 以5%的接种量 将种子液接种于ph 值为5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 的发 酵培养基中, 22, 120 转 /min 摇床培养7d 后测发 酵液中粗多糖含量, 每组ph平行作3个摇瓶, 取平 均值。结果见表3、图1。表3 不同ph值对粗多糖产量的影响ph值5.06.06.57.07.5粗多糖产量(g/l) 4.655.315.654.823.852.2.2不同培养温度对胞外粗多糖产量的影响以5% 的接种量接种种子液于发酵培养基摇由结果可知, 在ph6.5, 22, 培养天数为7 天的条件下, 冬虫夏草菌丝体发酵产胞外多糖产量 最高。在此条件下进一步进行试验, 最后测得胞 外粗多糖产量的平均值为5.86g/l。瓶中,在ph6.5 条件下, 分别在18、20、22、24、26五个温度, 在每个温度条件下作3个摇瓶发酵, 120转/min摇床培养7d后测发酵液中粗多 糖含量, 结果取平均值。试验结果见表4、图2。3组合试验a2b3c1粗多糖产量( gl)a2b3c2粗多糖产量(g /l)1235.305.185.155.495.425.38平均值5.215.43发 酵 科技 通 讯第 36 卷本文对种子液的接种量、发酵过程中的溶氧以及发酵过程中补糖量对冬虫夏草粗多糖产量的影 响正在进行试验, 有关结果将在下文中继续报道。讨论3冬虫夏草及虫草多糖由于具有极高的药用价值, 受到人们越来越多的关注。冬虫夏草的液 体发酵可以通过工业化生产大量获得虫草多糖, 达到产业化目标。但是目前液体发酵生产虫草多 糖产量不是很高, 采用的发酵培养基配方和发酵 条件不很合理。三组因素三水平正交试验结果表 明, 冬虫夏草液体摇瓶采用此条件进一步试验, 发酵条件以ph6.5、培养温度22、培养时间以7d 为宜, 结果粗多糖的产量最高, 为5.86g/l。采用优选出的液体培养基配方进行冬虫夏草的液体发酵获得终产物虫草多糖, 培养基原料 具有来源广泛, 成本合理, 产量较高的特点, 本文 试验初步确定了适合的冬虫夏草液体发酵条件, 为进一步的工厂化生产打下了良好的基础。参考文献1王菊凤等. 虫草多糖的 研 究 进 展 , 中 草 药2006.37(5)2张惟杰复合多糖生化研究技术 上海科学技术出版社 1987.6- 73许超德 冬虫夏草的研究进展 菌物研究,2006.4(2)4 周海钧等主编 卫生出版社( 第二版)生物检定统计方法 人民!发酵科技通讯第三届编委会初定名单公告( 继续征求意见稿)主任: 冯容保副主任: 于信令、王家勤、王宏龄、高 君、刘森芝、徐国华、陈 宁、邱志成编 委: 赵二红、曹培元、郑 毅、林 琳、杨玉岭、李友明、李欣泽、张 霞、冯廷兴、魏光禄、 汤忠发、叶 明、王焕章、杨久芳、龚旭明、陆飞洁、王东阳、程长平、朱卫国、马吉银、 高年发、施庆珊、柏建新、邓其建、童永和、杭文荣、云逢霖、王定昌、汪国刚、朱鸿飙、 顾复昌、韩勤更、金新梅、盛自华、林瑾琳、周秀琴、汪浪浪、劳建民、韩雨人参加编委会条件:1.具有为行业服务的奉献精神;2.在行业内有一定的影响力和知名度, 一般应是本企业的技术负责人;3.具有