弧菌科和气单胞菌科的常规检查.ppt

第十章 弧菌科和气单胞 菌科的常规检查 石河子人民医院检验科 王乐 n弧菌科包括弧菌属和发光杆菌属，是一大群菌体短小、弯 曲成弧形、具有单端鞭毛、运动活泼、氧化酶试验阳性的 革兰阴性菌。 n该类细菌广泛分布于自然界，以水中居多，人体肠道中偶 有此类细菌存在。 n弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属鉴别要点 试验 弧菌属 气单胞菌属 邻单胞菌属 甘露醇 +/- + - 鸟氨酸 +/- - + 精氨酸 +/- +/- + O/129敏感 S R S TCBS生长 + - - 嗜盐性 +/- - - 第一节 弧菌属 n是一群氧化酶阳性，发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂 O/129敏感的细菌，钠离子能刺激其生长，其中 有些菌株具有嗜盐特点（在无盐时不能生长）。 n目前发现本属细菌共有36个种，其中12种已被证 明能引起人类感染或可从临床标本中分离得到。 最重要的是： 霍乱弧菌 副溶血弧菌 一、霍乱弧菌 （一）分类与特征 霍乱弧菌是引起烈性传染病霍乱的病原体。该菌 分为古典生物型和埃尔托（Eltor）生物型。 霍乱发病急，传染性强，死亡率高。 自1817年以来，已发生过7次世界性霍乱大流行， 前6次均由霍乱弧菌古典生物型引起，1961年开始 的第7次大流行由霍乱弧菌Eltor生物型引起。1992 年在印度、孟加拉等国发现一个新的流行株O139 。 形态与染色 从患者体内新分离的霍乱弧菌形态典 型，菌体弯曲呈弧形或逗点状，革兰 染色阴性，菌体的一端有长为菌体3-5 倍的单鞭毛，在米泔水样粪便标本中 排列呈鱼群状。该菌运动活泼，呈穿 梭样或流星状。 G- ，逗点状，1 根鞭毛，有菌毛。 病人粪便作悬滴标本，可见“鱼群样穿梭”。 无芽胞，无荚膜。 霍乱弧菌的革兰染色 霍乱弧菌米泔样粪便直接涂片镜检 培养和生化反应 n兼性厌氧，最适生长温度35，耐碱不耐酸 ，在PH7.4-9.6范围内能生长，尤其在PH8.8 -9.0碱性蛋白胨水或碱性琼脂平板上生长良 好。 n营养要求不高，在普通营养琼脂上生长良 好。初次分离时常用碱性蛋白胨水增菌， 由于其他杂菌受到抑制，而霍乱弧菌经6-9 小时可在液体表面大量繁殖，形成菌膜。 n在碱性琼脂平板上，经18-24小时培养，形 成较大、圆形、扁平、无色透明或半透明 似水滴状的菌落。 n在选择性培养基硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐 -蔗糖琼脂平板（TCBS）上，霍乱弧菌可形 成较大的菌落，因发酵蔗糖产酸而使菌落 黄色。 n在含亚碲酸钾的琼脂平板上，因还原亚碲 酸钾成金属碲，形成中心呈灰褐色的菌落 ，较易辨认。 n在血琼脂平板上形成的菌落较大， Eltor生物型可产生溶血环。 n在SS琼脂平板上通常不长，麦康凯 琼脂平板上多可生长。 霍乱弧菌在TCBS平板上菌落形态 霍乱弧菌在亚碲酸钾平板上菌落形态 抗原结构与分型 n霍乱弧菌具有耐热的O抗原和不耐热的 H抗原。H抗原为弧菌属所共有，无特 异性。O抗原特异性高，根据O抗原的 不同可把霍乱弧菌分成200多个血清群 。 n其中O1群霍乱弧菌包括霍乱弧菌的古 典生物型和Eltor生物型。 霍乱弧菌的两种生物型的鉴别 生物型 生物学特性 古典生物型 Eltor生物型 V-P试验 - + 溶血性（羊红细胞） - + 50U多粘菌素B纸片 S R 鸡红细胞凝集 - + 噬菌体组裂解 + - 噬菌体组裂解 - + 霍乱弧菌古典生物型对多粘菌素B敏感 霍乱弧菌Eltor生物型鸡红细胞凝集试验阳性 n非O1血清群的霍乱弧菌广泛分布于地面水 中，可引起人类胃肠炎，但从未引起过霍 乱流行。因这些血清群的细菌均不与O1群 抗血清发生凝集，故称为非O1群霍乱弧菌 ，以往又称为不凝集弧菌。 nO139群既不被O1群抗血清所凝集，亦不被 O2-O138群抗血清凝集，目前认为它可能是 霍乱弧菌Eltor生物型菌株O抗原变异株。 抵抗力 n对热、日光、干燥、酸、消毒剂敏感，但耐碱力 较强。100煮沸1-2分钟可杀灭细菌。在正常胃酸 中仅可存活4分钟，以1份含氯石灰加4份水处理患 者的排泄物或呕吐物1小时可达消毒的目的。 nEltor生物型在自然界生存能力较古典生物型强， 其在河水、井水及海水中科存活1-3周。 n对链霉素、氯霉素和四环素敏感，但Eltor生物型 对一定浓度的多粘菌素B及庆大霉素有耐受性。 二、临床意义 n霍乱弧菌引起烈性肠道传染病霍乱，霍乱 为我国法定的甲类传染病。 n人类是唯一易感者。 n传染源是患者和带菌者。 致病机制 n细菌通过污染的水或食物经口进入机体而 感染，进入人体小肠内的霍乱弧菌，借助 其鞭毛的运动及弧菌黏蛋白溶解酶和黏附 素的作用穿过黏液层，并通过菌毛黏附于 肠黏膜上皮细胞上，大量繁殖产生霍乱肠 毒素，该毒素作用于肠黏膜表面受体，使 肠黏膜细胞的分泌功能亢进，造成肠液的 大量分泌，致使患者出现剧烈腹泻与呕吐 ，泻出物与呕吐物呈米泔水样，可致严重 脱水，电解质紊乱和代谢性酸中毒。 n如治疗不及时，患者常因肾衰竭和休克而 死亡，若及时补充液体和电解质，则大多 数患者可在数日内恢复。 n霍乱弧菌古典生物型所致疾病较Eltor生物 型严重。近年来，由O139群霍乱弧菌所引 起的霍乱暴发流行有上升的趋势，应给予 高度重视。 n霍乱病后可获得牢固免疫力，主要是体液免疫。 n改善卫生条件，加强水源、食品、粪便的卫生管 理，不生食贝壳类水产品等是预防霍乱弧菌感染 和霍乱流行的重要措施。加强国境检疫。同时有 计划得进行疫苗接种，提高人群免疫力。 n及时发现、隔离、治疗患者。治疗的关键是补液 ，纠正水、电解质紊乱，预防大量失水导致的低 血容量休克和酸中毒。同时使用有效抗菌药物进 行治疗。 （三）微生物学常规检验 n标本的采集与运送 发病早期及使用抗菌药物前采集标本 采集米泔水样粪便或呕吐物或肛拭等标本 标本及时接种，不能及时接种者，可将标本 置于文-腊氏保存液内或卡-布保存液内运送 。带菌者可用无菌棉签挑取粪便标本或肛 拭标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养 基，35增菌6-8小时。 检验程序 标本 增菌培养 快速诊断 直接涂片 （碱性蛋白胨水） 动力、制动试验 6-8小时 分离培养 （TCBS、碱性琼脂平板） 18-24小时 血清学鉴定 初步报告 生化鉴定、分型 确诊报告 检验方法 n1.直接镜检 （1）直接涂片：取标本直接涂片，干燥固定 后革兰染色，油镜下可见鱼群状排列的 革兰阴性弧菌。 （2）动力及制动试验：取米泔水样粪便制备悬滴（ 或压滴）标本，观察细菌动力，可见穿梭及流星 状运动的细菌。同法另制备一标本片，加入1滴O1 群霍乱弧菌多价诊断血清（效价64倍），可见运 动活泼的细菌停止运动，并发生凝集，此为制动 试验阳性。 n2.快速诊断 免疫荧光菌球法、SPA协同凝集试验、溶原 性噬菌体检查等 n3.分离培养 35增菌培养6-8小时 常用TCBS琼脂和碱性琼脂平板 4.鉴定 三个步骤 1）确定血清群：与O1群抗血清作凝集试验O1群、非O1群 2）确定血清型：与分型血清A、B、C凝集 3）生物分型:作生化试验古典生物型、Eltor生物型 O1血清分群 生物学分型 血清学分型 非O1群霍乱弧菌 霍乱弧菌 小川型 古典生物型 稻叶型 彦岛型 O1群霍乱弧菌 小川型 Eltor生物型 稻叶型 彦岛型 霍乱弧菌的主要鉴定依据 n（1）若细菌的菌落及形态典型，涂片为革兰阴性 弧菌或杆菌，运动活泼，氧化酶试验、靛基质试 验和黏丝试验阳性，与O1群霍乱弧菌的多价诊断 血清发生明显的凝集。可诊断为霍乱弧菌。 n（2）若细菌的菌落、形态及生化反应与霍乱弧菌 相似，但与O1群霍乱弧菌多价诊断血清不凝集， 应作进一步鉴定，以确定是否为非O1群霍乱弧菌 或其他类似弧菌。 n（3）根据流行病学调查的需要，可进一步用霍乱 弧菌的单价诊断血清作血清学分型。必要时还可 作噬菌体分型和生物分型。 二、副溶血性弧菌 n一种嗜盐性弧菌 n广泛分布于近海的海水、海底的沉 积物和鱼类、贝类海产品中 n主要引起食物中毒 （一）主要特征 n形态与染色 革兰阴性杆菌，随培养基不同菌体形态差异 较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、 弧形等多种形态。 该菌两极浓染，有周鞭毛或极端鞭毛，运动 活泼。 无芽胞，无荚膜。 培养特性与生化反应 n需氧或兼性厌氧 n营养要求不高，在3.5%氯化钠的培养基中 生长良好，无盐或氯化钠的浓度高于8%不 生长 n最适PH7.7-8.0，但PH9.5时仍可生长 n最适生长温度为35 n在碱性蛋白胨水中经35、6-9小时培养后 呈均匀浑浊生长，并形成菌膜。 n在TCBS平板上形成0.5-2.0mm大小、不发酵蔗糖的 绿色或蓝绿色菌落。 n在3.5%食盐琼脂平板上菌落圆形、隆起、边缘不 整齐、光滑湿润不透明，并呈蔓延生长。 n在血液琼脂平板上形成较大（直径2-3mm）圆形 隆起、湿润并略带灰色或黄色的菌落。某些菌株 可呈溶血。 n在SS琼脂上，部分菌株不生长，能生长的菌落较 小（1-2mm）、扁平、无色半透明、蜡滴状，有 辛辣味，不易挑起。 n初次分离时，该菌不能在伊红美蓝琼脂或中国蓝 琼脂上生长，部分菌株可在麦康凯平板上生长， 菌落呈圆形、边缘整齐、半透明或混浊状。 n副溶血性弧菌的生化反应培养基中需加入 3.5%NaCl。 n几乎所有自患者粪便中分离的致病性菌株 都能溶解人和兔红细胞，不溶解马红细胞 ，称神奈川现象。而从海水及海产品中分 离的非致病菌株多不能溶解人和兔红细胞 。 抗原构造 n副溶血性弧菌有菌体(O)抗原、荚膜(K)抗原 及鞭毛(H)抗原。 nO抗原共有13种，是副溶血性弧菌分群的依 据。K抗原有68种，可根据K抗原和O抗原 的组合进行定型。 抵抗力 n对氯、苯酚（石炭酸）、甲酚皂（来苏尔）等消 毒剂敏感，不耐热，65 30分钟即被杀死。 n在淡水中生存不超过2日，但在海水中能生存47天 以上，盐渍酱菜中存活30天以上。 n耐碱不耐酸，在2%冰醋酸或食醋中5分钟死亡。 n对氯霉素敏感，对新霉素、链霉素、多粘菌素、 呋喃西林、吡哌酸中度敏感，对青霉素、磺胺嘧 啶耐药。 二、临床意义 n从致病性副溶血弧菌中分离出两种致病因 子： 1、耐热直接溶血素，其作用是通过增加上 皮细胞内的Ca2+而引起Cl-的分泌，实验表 明，该溶血素还具有细胞毒和心脏毒作用 。 2、耐热相关溶血素，其作用与耐热直接溶 血素相似。 此外，黏附素与黏附素酶也与致病性有关。 n人因食入被副溶血性弧菌污染而烹饪不当的海产 品，如海蜇、海鱼、海虾、海贝等，或盐渍食物 ，如咸菜、咸肉、咸鱼等而引起食物中毒。潜伏 期平均24小时，患者可出现腹痛、腹泻、呕吐、 发热等症状，粪便多为水样或糊状，少数为血水 样。多发于夏秋季节，一般恢复较快。病后免疫 力不强。 n该菌偶尔引起肠道外感染，如中耳炎、伤口感染 等。 （三）微生物学常规检验 n标本采集 常规标本为患者粪便、肛拭子、可疑食物 。 该菌对干燥敏感，标本采集后立即送检， 如不能及时送检，应将标本置于1%NaCl的 碱性蛋白胨水或含3.5%NaCl蛋白胨水中， 35增菌培养6-8小时。挑取菌膜或表面生 长物进一步分离培养。 检验程序 标本 增菌培养（3.5%NaCl蛋白胨水） 分离培养（TCBS或3.5%NaCl琼脂） 可疑菌落（蔗糖阴性的绿色菌落） 纯培养（营养琼脂或KIA） 毒素鉴定 鉴定（生化、血清学试验） 检验方法 n1.增菌培养 将标本接种到含1%NaCl的碱性 蛋白胨水或含3.5%NaCl蛋白胨水中，35 增菌培养6-8小时。挑取菌膜或表面生长物 进一步分离培养。 n2.分离培养 将标本或上述增菌液接种于 TCBS平板、3.5%NaCl琼脂平板或SS琼脂平 板上，35培养18-24小时后，观察菌落特 征。 n3.鉴定 副溶血性弧菌在不含NaCl和含 10%NaCl的蛋白胨水中不生长，在含 3%NaCl和含7%NaCl的蛋白胨水中生长； 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验阳性，精氨酸 双水解酶试验阴性，脲酶多为阴性，少数 为阳性。从腹泻患者中分到的多数菌株神 奈川现象阳性。 n4.与溶藻弧菌鉴别 由于从食物和粪便中经常能分离到溶 藻弧菌，该菌在海水和海产品中分布也较多。溶藻弧菌主 要引起伤口感染和中耳炎，也可引起食物中毒和败血症。 溶藻弧菌和副溶血性弧菌同属弧菌属6群，其生化反应非 常相似，应注意两者之间的鉴别。 溶藻弧菌 副溶血性弧菌 蔗糖发酵试验 + - VP试验 + - 7%NaCl中生长 + + 10%NaCl中生长 + - 溶藻弧菌在TCBS平板上的菌落特征 溶藻弧菌在麦康凯平板上的菌落特征 第二节 气单胞菌属和邻 单胞菌属 一、气单胞菌属 （一）分类与特征 n气单胞菌属隶属气单胞菌科，广泛存在于自然界 ，可从土壤、水源及人的粪便中分离出来，与人 类疾病相关的主要有豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞 菌、简氏气单胞菌、维氏气单胞菌、舒氏气单胞 菌和易损气单胞菌等。 n冷血动物为其重要宿主，是人类感染的主要来源 。 n以往认为气单胞菌属是毒力较弱的条件致病菌， 但目前已陆续发现该菌属与人类疾病有关，尤其 当机体防御机能减退时，更易引起机体严重感染 。 本属细菌为革兰阴性直杆菌，也可呈球杆状或丝状 ，除杀蛙气单胞菌外，均有单端鞭毛，呈穿梭状 运动，无荚膜，有芽孢。 生物学特征1 n培养特性 n生长温度范围较宽，嗜中温菌为045，嗜低温菌生长温 度为10-15，35 不生长。 n需氧或兼性厌氧。 n营养要求不高，能在普通培养基上生长，TCBS培养基不生 长。 n在血琼脂平板上经3524-48小时的培养，形成白色、光滑 、稍凸起、直径约2mm左右的菌落，嗜水气单胞菌可形成 溶血环。 n在麦康凯及SS平板上形成扁平无色、稍浑浊、无臭味的乳 糖不发酵菌落。 生物学特征2 n杀蛙气单胞菌在含有苯丙氨酸或酪氨酸的琼脂平板上产生 棕色或黑色色素。 n氨苄血琼脂（羊血琼脂中加入氨苄西林30g/ml）可作为 此菌选择性培养基，其中氨苄西林可抑制杂菌生长，对气 单胞菌有刺激生长的作用，其菌落为2mm大小，灰白色， 湿润状。 n本属细菌氧化酶、触酶阳性，发酵葡萄糖产酸，在含 6%NaCl培养基中不生长。 （二）临床意义 n肠道内感染 n以温和生物变种所致感染最多见。主要表现为急性腹泻。 n常见5岁以下儿童和成人，夏季腹泻的第二、三位病原菌 n主要致病物质为溶血毒素和细胞毒素等 n肠道外感染 n主要为伤口感染和菌血症。亦可引起心内膜炎、脑膜炎、肺炎、 骨髓炎、腹膜炎、关节炎、血栓性静脉炎和胆囊炎等。 n皮肤和软组织感染，主要由亲水气单胞菌和维隆气单胞菌引起。 n90%以上菌血症由亲水气单胞菌和维隆气单胞菌引起，通常发生 在免疫低下人群。 （三）微生物学常规检验 n标本采集 根据感染部位不同，采集脓汁、分泌物、粪便、尿液及 血液等。 n检验程序 标本 增菌培养（碱性蛋白胨水） 分离培养 3518-24小时 纯培养 初步生化反应 全面生化反应 肠毒素测定 （氧化酶、TCBS生长、O/129、耐盐试验） 检验方法 n1.直接涂片 取浓汁、分泌物及尿沉渣等标本作直接涂片，可查见革兰阴性短杆 菌。用悬滴法可观察到细菌运动活泼。 n2.分离培养 脓汁标本可直接接种血液琼脂平板。 血液标本先经肉浸液或胰化酪蛋白大豆肉汤增菌，再转种 血液琼脂平板。 粪便标本接种肠道选择性培养基。 部分标本可接种于PBS，置4增菌，于1、3、7、14天后 接种到琼脂平板上，置35 培养24-48小时后观察