微生物数量的测定.ppt

微生物数量的测定 v微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现 为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。 v测定微生物数量的主要方法： 显微镜直接计数法（不辨死活） 平板菌落计数法（形成菌落的微生物） P32 光电比浊法（不用于颜色太深的样品） 测定细胞重量法（测定丝状真菌生长量） 测定细胞总氮量或总碳量（适于浓度较高的样品） 。 实验十一、显微镜直接计数法 目的要求 v了解血球计数板的构造、计数原理和计 数方法； v掌握显微镜下直接计数的技能。 v显微镜直接计数法是将小量待测样品的 悬浮液置于一种特别的具有确定面积和 容积的载玻片上，于显微镜下直接计数 的一种简便、快速、直观的方法。 直接计数法优缺点 v优点：直观、快速、操作简单。 v缺点： 不能区分死菌与活菌，所得为总数； 不适于对运动细菌的计数。 常用计菌器 v常用计数器有血球计数板(血细胞计数板) 、Petroff-Hauser计菌器以及Hawksley计 菌器等。 v各种计数板的计数原理相同，只是血球计 数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数 较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌 器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直 接计数细菌。 血球计数板 Petroff-Hauser计菌器 Hawksley计菌器 v 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。 v 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。 v 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。 v 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。 v 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。 v 计数室的刻度一般有两种规格： 一种是一个大方格分成25个中方 格，而每个中方格又分成16个小 方格；另一种是一个大方格分成 16个中方格，而每个中方格又分 成25个小方格。 v 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。 v 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。 v 计数室的刻度一般有两种规格： 一种是一个大方格分成25个中方 格，而每个中方格又分成16个小 方格；另一种是一个大方格分成 16个中方格，而每个中方格又分 成25个小方格。 v无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是 400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为 lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所 以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。 计数方法 v计算： 1mL菌液中总菌数 =A/5*25*104*B=50000*A*B 1mL菌液中总菌数 =A/5*16*104*B=32000*A*B 其中B为稀释倍数。 v使用血球计数板计数时，通常数5个中方格的总菌 数A，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（ 计数室）中方格的数量，就得出一个大方格中的总 菌数。数两个大方格总菌数，平均后，再换算成每 毫升菌液中微生物细胞的数量。 注意事项 v对于出芽的酵母菌，芽 体达到母细胞大小一半 时，即可作为两个菌体 计算。 v对于压线酵母，按照数 上不数下、数左不数右 的原则计数 实验器材 活材料： 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养液 。 其他器材： 显微镜、血球计数板 、电吹风、盖玻片（ 22mm22mm）、吸水 纸、计数器、滴管、 擦镜纸。 实验方法 1、用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液（以 每个小方格中510个菌为宜）。 2、取洁净的血球计数板一块（事先镜检），盖上一块盖玻 片。 3、将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘摘 入一小滴，让菌悬液利用毛细渗透作用充满计数区。 4、加样后静止5min，将计数板置显微镜载物台上，先用低 倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数。（光不宜太强） 5、计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，用 电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。 作业 结果（填表） P55 实验十二、光电比浊计数法 v了解光电比浊计数法的原理。 v学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。 目的要求 基本原理 v当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射 及吸收作用使光线的透过量降低。 v在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反 比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以 由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌 数的菌悬液测定光密度，作出光密度-菌数标准 曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标 准曲线中查出对应的菌数。 光电比浊计数法优缺点 v优点：简便、快速、连续测定、适合自动化。 v缺点： 光密度受细胞大小、形态、培养液成分以及选用的 波长的影响； 对于不同微生物的菌悬液要选择相应的菌株和培养 条件制作标准曲线； 对于颜色太深的样品或含其它具有吸光值的物质不 能用此法。 器材 v菌种 酿酒酵母培养液 v仪器或其他用具 分光光 度计，血细胞计数板，显 微镜，试管，吸水纸，无 菌吸管，无菌生理盐水等 。 操作步骤 v标准曲线的制作 v样品测定 每毫升细胞数 光密度值 标准曲线的制作 1、血球计数板直接计数：首先采用血球计数直接计 数酿酒酵母菌悬液。（ 2108菌/mL ） 2、稀释菌液：将上述已知浓度的酿酒酵母菌悬液用 无菌生理盐水进行两倍梯度稀释,共稀释6个浓度: 1108、 5107、 2.5107、 1.25107、 6.25106、 3.125106。 3、测OD值：以无菌生理盐水作为对照，于波长 560nm处用1cm比色杯测定上述各菌液的OD值。 4、以OD值为纵坐标，每毫升菌数为横坐标，绘制标 准曲线。 样品测定 1、稀释样品：将待测菌悬液用无菌生理盐 水适当稀释。 2、在560nm波长用1cm比色皿测定稀释后菌 悬液的光密度。 3、计算：根据所测得的光密度值，从标准 曲线查得每毫升的含菌数，乘以稀释倍 数就得到原液中细菌数。 721型分光光度计操作方法 v 接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10至 15分钟。 v 将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时 ，需选用较高档）。根据所需波长转动波长选择钮。 v 将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外 壁，放入样品