化学物的一般毒性及其评价.ppt

第六章 化学毒物一般毒性作用 及其评价（1） 公共卫生学院卫生学教研室 一般毒性（general toxicity）是指外源化 合物在一定的接触剂量、一定的接触时 间和一定的接触方式下对实验动物产生 综合毒效应的能力。 分类 急性毒性：acute toxicity 亚慢性毒性：subchronic toxicity 慢性毒性：chronic toxicity 第一节 急性毒性作用 一.急性毒性的概念 是指机体一次或在24小时内多次接触外 源化学物后在短期内(一般最长14天)所产生 的毒效应，包括一般行为和外观改变，大体 形态变化以及死亡效应。 二、急性毒性试验目的 1.获得受试物对实验动物的致死剂量 （LD50）及 其它毒性参数(急性毒作用带Zac: acute effect zone) Zac=LD50 / Limac 2 .初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、 剂量反应关系和对人体产生损害的危险性 3 .为亚慢性、慢性毒性试验及其他毒理学试验的 剂量设计和观察指标选择提供参考依据。 4.为急性中毒的治疗和中毒机制的研究提供线索 三、急性毒性试验设计 （一）实验动物的选择 主要原则 .对受试物的反应与人近似 .实验操作方便,易于饲养管理 .繁殖能力强，数量较大能保障供应 .价格较低且易于获得 1.实验动物的物种和品系 A:首选哺乳动物,其中以大小鼠为最常用 B: 使用两种种属动物:啮齿类和非啮齿 类(rodent species and non- rodent species ) : 不同的接触途径选择实验动物的种 类有所不同 2 .动物的年龄和体重 除特殊情况外一般要求选用刚成年未曾 交配和受孕的健康动物 大 鼠 180-240g 小 鼠 18-25g 家 兔 2-2.5kg 豚 鼠 200-250g Beagle犬 4-6kg 3 .实验动物的性别 通常要求雌雄各半如有资 料或预试验发现受试物对雌雄 动物毒效应有明显的性别差异 ，则要求分别求出各自的LD50 4 .实验动物的分组与数量 不同的实验计算方法对动物组数要 求不同，一般4-6组；大小鼠10只/组， 犬等大动物6只/组.分组时严格遵循随 机化原则 5 .实验动物的预检 目的: ：适应环境 ：筛检不健康动物 6 .实验动物的给药前禁食处理 经口染毒要求作禁食处理 （二）受试物及其处理 受试物常用剂型为: 水溶液: 用蒸馏水或生理盐水配制 油溶液 混悬液 天然植物油、10%的阿拉 伯乳胶 （三）染毒方法的选择 急性毒性染毒途径的选择应考虑以下几个因素： 、人类接触该物质的实际途径和方式 、受试物的性质和用途 、有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较 、各种受试物评价程序的要求 1. 经口染毒 经口染毒可分为灌胃、喂饲、吞咽胶 囊等方式 .一般来说新物质均先进行经口 染毒途径的急性毒性试验,求出LD50值,通 常用该LD50值来比较不同化学物急性毒性 大小 2. 经呼吸道染毒 气管内注入：在动物麻醉情况下，将已消毒 灭菌的受试物（粉尘混悬液或液体 ） 注入气管，使之分布于左右肺内。 动式吸入 吸入 静式吸入 静式吸入染毒 将实验动物置于一个具有固定体积的容器内(染毒 柜)，定量加入易挥发的液态或气态受试物，在 容器内形成试验设计所需要的空气浓度，在一 定时间内，使动物连续吸入并观察毒性反应。 优点：该染毒方式设备简单、操作方便、消耗受 试物较少。 缺点：实验期间，实验动物得不到氧气补充；且 随实验的进行，染毒柜内受试物的浓度会逐渐 降低 为保障实验顺利进行，应注意染毒柜容积、放置 实验动物的种类与数量以及放置时间之间的关 系。 小鼠最低需气量：3.45L/h, 大鼠30.5L/h 动式吸人染毒 是将实验动物置于空气流通的染毒柜中 。染毒柜装备有新鲜空气输入和随时补充 受试物的配气系统以及将含有受试物的空 气排除的动力系统。 优点：可保证实验过程中染毒柜内的氧 和C02分压、温湿度及受试物的浓度均相 对恒定 缺点：装置复杂、价格昂贵、消耗受试 物较多 3. 经皮肤染毒 经皮肤染毒所选用的实验动物应在皮肤解 剖、生理等方面与人类近似，以豚鼠、家 兔最为合适 脱毛 化学法脱毛 机械法脱毛 硫化钡+滑石粉1：4 硫化钠+滑石粉1：4 4. 经注射途径染毒 进行化学毒物的毒作用机制研究、比较毒 性研究、毒物动力学研究和急救药物的筛 选研究时，常采用经注射途径染毒的方式 。注射染毒途径有经腹腔、静脉、肌内、 皮下等。 操作时需注意控制注射液的容积和注射的 速度 几种动物不同注射染毒途径注射量范围(ml) 注射途径小鼠大鼠豚鼠兔 狗 静脉0.2-0.51.0-2.0 1.0-5.0 3.0-10.0 5.0-15.0 肌内0.1-0.20.2-0.50.2-0.5 0.5-1.0 2.0-5.0 皮下 0.1-0.5 0.5-1.00.5-1.01.0-3.03.0-10.0 腹腔 0.2-1.0 1.0-3.0 2.0-5.05.0-10.0 （四）染毒剂量与分组 急性毒性试验的重要目的是测定LD50， 欲求一个未知毒性的受试物的LD50 ，必须 设计好分组数与染毒剂量，这往往需要通 过预实验来确定。 预实验: 先查阅相关文献, 弄清该化学物 的理化特性和与该化学物结构及理化性质 相似化学物的LD50用少量动物，以较大 剂量间隔染毒，找出10%-90%或0%- 100%的致死剂量范围 正式试验：设置几个剂量组较为合适， 取决于预备实验的结果。即根据LD0(或LD10) 与LD100(或LD90)之间剂量相差的多少决定。 相差的多，可适当增加组数，反之可适当减 少组数。组数的确定还要考虑计算LD50的方 法。如使用几率单位法、寇氏法计算，一般 设置4-6个剂量组，并按下式计算组距： i=LD100(或LD90)LD0(或LD10)n(组数)-1 i为组距,相邻的两个剂量组对数剂量之差 使用霍恩法计算，则固定设4个剂量组，组 距可分别定为2.15倍或3.16倍 （五）毒效应观察 观察染毒后实验动物的中毒表现，对于了解受 试物的急性毒作用特征非常重要，可以弥补单 纯以LD50(LC50)表示化学毒物急性毒性的局限性 ，还有助于估测毒作用的靶器官。 急性毒性试验的观察和记录内容主要包括: 中毒体征及发生过程 死亡情况和时间分布 体重 病理检查 (六)观察时间和周期 急性毒性的观察周期一般为天，LD50 计算时以观察周期内各组动物的总死亡数 为依据不同化学物其中毒体征出现的时 间和特点各有不同，而且引起动物死亡的 时间也存在很大的个体差别如氰化物多 数动物在染毒后几分钟至几个小时内死亡 ；羰基镍染毒早期出现上呼吸道体征，很 快就缓解，但天后甚至更迟些又出 现明显的中毒体征，表现为严重的肺水肿 ，呼吸困难，然后死亡 四急性毒性分级和评价 急性毒性试验求出LD50值，通过LD50值 进行毒性分级，评价毒物的急性毒性强弱 ，比较毒物的急性毒性大小 1453外来化合物急性毒性分级(WHO) 毒性分级 大鼠一经 口LD50 (mg/kg) 6只大鼠吸入h ，死亡-只 的浓度(ppm) 兔经皮 LD50 (mg/kg ) 对人可能致死的剂量 g/kg总量（g/60kg） 剧 毒151000 五 LD50的计算 LD50的计算方法很多，其中较常用的有 改进寇氏法 霍恩法 序贯法 Bliss法 改进寇氏法 原理：剂量对数与死亡率呈型曲线 要求：每剂量组动物数相同 各剂量组组距呈等比级数 死亡率呈正态分布 最低剂量组死亡率20%,最高 剂 组80% 计算公式： m=Xk-i(p-0.5) Sm=i (pq/n)1 / 2 试中的m: lgLD50 i: 相邻两剂量组之对数剂量之差 Xk:最大剂量的对数值 q :各剂量组死亡率总和 n :每组动物数 组别 剂量动物数死亡数死亡率 存活率 pq mg/kg对数（n）（n）pq 1151.1761100010 2181.25611020.20.80.16 321.71.33611050.50.50.25 426.11.41611070.70.30.21 531.31.49611090.90.10.09 i=0.08 p=2.3 lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5) =1.3521 Sm=0.08 (0.16+0.25+0.21+0.09)/101/2 =0.0213 lgLD50及其95%可信限为: 1.35211.960.0213=1.35210.0417 LD50及其95%可信限为: 22.50mg/kg(20.44-24.76) 霍恩法 霍恩法是利用剂量对数与死亡率（反应率） 的转换数（即几率单位）呈直线关系而设 计的 霍恩法则固定设4个剂量组，组距可分别定为 2.15倍或3.16倍，形成两个剂量系列 优点：使用动物数少，结果可直接查表求出 LD50及95%的可信区间，使用方便 缺点： 95%的可信区间范围较大，方法精确 度不够 第二节 蓄积毒性作用 一. 蓄积作用的基本概念 1.蓄积作用(accumulation)是指化学毒物连续 或反复多次地与机体接触，当其吸收速度超 过生物转化和排泄的速度时，在体内的总量 就会逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒 物的蓄积作用。化学物蓄积部位称为储存库 。蓄积作用是发生慢性中毒的基础。 2.物质蓄积(material accumulation):当人或动 物连续或反复多次地接触化学毒物一定时间 之后，用化学分析的方法能够测出机体内存 在该物质或其代谢产物时，称为物质蓄积。 3.功能蓄积(functional accumulatio):当人或动 物连续、反复多次地接触化学毒物一定时间 之后，虽不能测出该物质或其代谢产物，但 机体有慢性中毒的症状出现，这种情况称为 功能蓄积。功能蓄积是化学毒物引起的损害 效应不断积累的结果，也可能是由于滞留于 机体内的化学毒物或其代谢产物数量极微， 用现有的分析方法不能检出。 二.蓄积毒性研究方法 （一）蓄积系数法 （二）生物半减期法 （一）蓄积系数法 1. 原理: 在一定期限之内，以低于致死剂量的 受试物(小于LD50剂量)每日给予实验动物， 直至出现预计的毒性效应(如死亡一半)为止 ，计算达到预计效应的总累积剂量，求出此 累积剂量与一次接触该物质产生相同效应的 剂量的比值，此比值即为蓄积系数(K值) 2. K值计算公式如下： K=LD50(n)LD50(1) LD50(n)表示引起一半动物死亡的累积总剂 量LD50(1)表示引起一半动物死亡的一次剂量 3.蓄积毒性分级标准 K值越小，表示化学毒物的蓄积性越大 K值增大，通常认为K5者，蓄积作用极弱 蓄积系数K蓄积毒性分级 1高度蓄积 1-明显蓄积 3-中度蓄积 5-轻度蓄积 4. 蓄积系数法常用的实验方案 .固定剂量法 在1/201/5LD50的范围内选定一个剂量组 ，每日以固定剂量，定时和相同途径对试 验组进行染毒，观察记录动物死亡数。当 试验组累计发生一半动物死亡时终止试验 。计算累计总接触剂量LD50(n)，计算K值 。 试验期为25-100天 .剂量递增法 试验方案同，仅是实验开始时按0.1LD50剂量 给予试验组染毒，以4天为一期，按一定比例递 增染毒剂量。一般说来，试验的头4天，每日给 予0.1LD50 ,从第五天开始每4天为一期递增1.5倍 即0.1LD504, 0.15LD504, 0.22LD504 此方案 的最长时间为28天 接触天数14 58 2528 每天接触剂量LD500.10.151.12 4天接触剂量LD500.40.64.48 累计接触剂量 LD50 0.4112.74 .剂量固定的20天蓄积法 通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机 分成五组，包括阴性对照组和1/20LD50， 1/10LD50，1/5LD50，1/2LD50四个剂量组 ，每组动物数10只。每日染毒一次，连续 染毒20天。观察每组雌雄合计动物数。 评价：均无死亡 蓄积性不明 显 仅1/2LD50有死亡 弱蓄积性 仅1/20LD50无死亡 中度蓄积 均有死亡，且有剂量反应关系 强蓄积 第三节 亚慢性和慢性毒作用 一. 亚慢性毒作用 (一).亚慢性毒性的概念 (二).亚慢性毒性试验的目的 (三).亚慢性毒性试验方法要点 (一).亚慢性毒性的概念 亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指 机体在较长时间内、连续或反复多次接触 较大剂量的化学毒物而产生的中毒效应。 所谓“较长时间”对于啮齿类动物通常为 16个月，所谓“较大剂量是相对于低剂 量而言，没有明确的剂量范围下限，但上 限应低于LD50。 (二).亚慢性毒性试验的目的 1.研究受试物亚慢性毒性剂量反应(效应)关系,确定 未观察到有害作用的剂量(NOAEL)和其观察到有 害作用的最低剂量(LOAEL), 提出安全限量参考范 围 2.观察受试物亚慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒 作用靶器官 3.观察受试物亚慢性毒性的可逆性 4.为慢性毒理试验的剂量设计和观察指标选择提供 依据 5.比较不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒性 机制研究和将研究结果外推到人提供依据 (三).亚慢性毒性试验方法要点 一般要求选择两个动物种属，即啮齿 类(如小鼠、大鼠、家兔)和非啮齿类(如狗 、猴)，以全面了解受试物的毒性特征。品 系多选择纯系动物，如大鼠常用Wistar和 SpragueDawley品系。个体选择一般选 择未成年的健康动物，如小鼠1517g， 大鼠80-100g，家兔1215kg。同组 动物体重相差不超过平均体重的10%，组 间平均体重相差不超过5. 1. 实验动物选择： 染毒途径的选择应尽量模拟人类在环 境中接触该受试物的途径或方式，并与预 期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。 主要有: 经消化道：可用灌胃法或喂饲法。一般 常用喂饲法，即将受试物与食物或饮水混 匀，使动物自然摄入。狗、猴等大动物通 常使用胶囊或插胃管染毒经呼吸道和经皮 肤三种 2. 染毒途径 经呼吸道：可采用静式或动式染毒。 每天吸人时间依试验要求而定。如工 业毒物为14小时，环境毒物为46 小时； 经皮肤：一般每天染毒4-6小时，注 意防止动物舔食。每周应对染毒部位 脱毛一次。 为了得到明确的剂量反应关系，一般 至少设三个剂量组和一个阴性对照组。高 剂量组应能引起较为明显的毒效应，但无 动物死亡或仅有个别动物死亡(少于10%) ；中剂量组应相当于观察到有害作用的最 低剂量(LOAEL)；低剂量组应相当于未观 察到有害作用的剂量(NOAEL)。具体剂量 可参考受试物的LD50确定。即以120 15LD50为高剂量组剂量，高、中、低各 剂量组间距在310倍之间，最低不小于2 倍。 3.染毒剂量与分组 4. 观察指标 (1). 一般性指标 1)外观体征和行为活动 每日观察实验动物出现的外观体征和行 为改变,记录各体征出现的时间先后顺序, 尤其注意被毛的光洁度与色泽、眼分泌物 、呼吸、神态、行为等。 2)动物体重：实验动物在生长发育 期的体重增长情况是综合反映动物健 康状况最基本的灵敏指标之一。化学 毒物可通过影响食欲、消化功能、代 谢和利用及能量消耗等使动物体重增 长异常。如各实验组动物体重增长异 常并有剂量反应关系，可以肯定是 一种综合毒性效应 3)饲料消耗量： 试验期间必须注意观察并记录 动物的饮食情况，在此基础上计 算食物利用率，即动物每食人 100g饲料所增长的体重克数 （2）实验室检查 1）血常规检查 包括红细胞计数、血红蛋白含量、白细 胞计数与分类、血小板计数和凝血时间等 2）血液生化指标 尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、血 糖（GLU）、总胆固醇（T-CHO）等 （3）系统尸解和组织病理学检查 1）脏器重量和脏器系数： 一般称取心、肝、脾、肺、肾、肾 上腺、卵巢或睾丸、脑等脏器湿重， 并记算其脏器系数。脏器系数：或称 脏体比值，是指某个脏器的湿重与 单位体重的比值，通常以100g体重计 。该指标比较适用于实质性脏器 2）病理学检查 组织病理学检查是亚慢性毒性试 验中最重要的检测指标之一，目的是 确定受试物对机体毒作用的靶器官、 损伤的性质和程度，获得其毒性作用 的形态学证据。 二. 慢性毒性作用 (一) 慢性毒性的概念 慢性毒性（chronic toxicity）: 是指实验动物或人长期（甚至终 生）反复接触外源化学物所产生 的毒性效应。所谓 “长期”一般指 两年 （二）慢性毒性试验目的 1.研究慢性毒性剂量-反应(效应)关系。确定长期接 触造成有害作用的最低剂量（LOAEL）和未造 成有害作用的剂量（NOAEL），为制定人类接 触时的安全限量标准，如最高容许浓度（MAC ）和每日容许摄入量（ADI）及危险度评价提供 毒理学依