基因操作与克隆载体

DNA的损伤原因： 1.DNA分子的自发性损伤 (1) DNA复制中的错误 (2) DNA的自发性化学变化 a.碱基的异构互变 b.碱基的脱氨基作用 c.脱嘌呤与脱嘧啶 d.碱基修饰与链断裂 2.物理因素引起的DNA损伤 (1) 紫外线引起的DNA损伤 (2) 电离辐射引起的DNA损伤 a.碱基变化 b.脱氧核糖变化、 c.DNA链断裂 d.交联 复习 3.化学因素引起的DNA损伤 (1) 烷化剂对DNA的损伤 a.碱基烷基化 b.碱基脱落 c.断链 d.交联 (2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 复习 分子改变类型： 点突变 (point mutation) ： 指 DNA 分子上一个碱基的变异（置换）。 (1)、转换 (transition) ：发生在同型碱基之间的置换 (2)、颠换 (transversion) ：发生在异型碱基之间的置换 突变效应： 同义突变 错义突变 无义突变 终止密码突变 抑制基因突变 移码突变 DNA的修复系统 (一)回复修复 1.光修复 2.单链断裂的重接 3.碱基的直接插入 4.烷基的转移 (二)切除修复(excision repair) (三)重组修复(recombinational repair) (四)SOS修复 复习 1 转座子的分类和结构特征 a. 简单转座子 转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位 的基本单位。 最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一 个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中 ，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移 动的蛋白。 b.复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因 （或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS 序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。 一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修 饰了，只能作为复合体移动。 重组与转座 2、转座作用的机制 转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段 很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座 子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对 于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如 IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。 转座可被分为复制性和非复制性两大类。 在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（ transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制 转座子。TnA类转座主要是这种形式。 在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位， IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。 重组与转座 转座子的应用 3. 反转录转座子(retrotransposon或retroposon)指通过RNA为中介，反转录 成DNA后进行转座的可动元件。这样的转座过程称为反转座作用(retrotrans position)。 4. 转座作用的遗传学效应 转座引起插入突变; 转座产生新的基因; 转座产生的染色体畸变; 转 座引起的生物进化. 目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研 究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类反转录转座子具有分布广、 异源转座高和受组织培养诱导激活等优势。 此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大 大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子。 二、限制性内切酶 1、限制性内切酶的定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具 有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切 割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。 2、限制性内切酶的发现 Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些 专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染， 而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化） 而得以保护，这种现象叫做限制修饰。 二、限制性内切酶 Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特 异性的切割DNA，这个酶被命名为Hind I,这是第一个分 离到的限制性内切核酸酶。 二、限制性内切酶 二、限制性内切酶 3、限制性核酸内切酶的命名 按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个 字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母 作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其 后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流 感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d） 中先后分离到3 种限制酶， 则分别命名为 Hind、Hind和Hind。 二、限制性内切酶 4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型： 类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专一，很少被应 用。 类型II ：是DNA重组技术最为常用的工具酶。 类型II 限制性内切酶的特点 识别位点严格专一 识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp 识别位点经常是一种回文序列的DNA 二、限制性内切酶 5、常见的限制性内切酶 限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 EcoR GAATTC Hind GTPyPuAC Hind AAGCTT BsuR I GGCC Pst CTGCAG Sma CCCGGG Xba TCTAGA Xho CTCGAG BamH GGATCC Not GCGGCCGC 二、限制性内切酶 6、限制性内切酶的切割方式 就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式 有三种: 在对称轴5 侧切割产生5 粘端 在对称轴3 侧切割产生3 粘端 在对称轴处切割产生平段 二、限制性内切酶 5 GAATTC-3 EcoRI G AATTC 5 粘端 3 CTTAAG-5 CTTAA G 5 CTC GAG-3 Pst I CTCGA G 3 GAG CTC-5 G AGCTC 3 粘端 5 CCC GGG-3 Sma I CCC GGG 平末端 3 GGG CCC-5 GGG CCC 二、限制性内切酶 二、限制性内切酶 7、限制酶产生末端的连接 a、粘性末端互补 -CTCGAAGCTTGTTC- -GGCAAGCTTACT- -GAGCTTCGAACAAG- -CCGTTCGAATGA HindIII酶解 HindIII酶解 -CTCGA- -AGCTTGTTC- -GGCA- -AGCTTACT- -GAGCTTCGA- -ACAAG- -CCGTTCGA- -ATGA- 混合退火 -G G C A A G C T T G T T C- -C C G T T C G A A C A A G- 切口 二、限制性内切酶 b、不匹配末端连接 -AAGCTT- -TCTAGA- -TTCGAA- -AGATCT HindIII Xba I -A CTAGA- -TTCGA T- Klenow酶填补 -AAG CTAGA- -TTCGA TCT- - A A G C T A G A - - T T C G A T C T - Klenow片段（克伦诺片段，Klenow fragment）： E.coli DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基 酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5-3聚合酶 和3-5外切酶活性，但缺少完整酶的5-3外切酶活性 。 它可用于填补DNA单链末端成为双链。 a、用于同位素标记DNA片段末端 b、合成cDNA的第二条链 c、Sanger双脱氧法进行序列分析 d、定位突变 二、限制性内切酶 二、限制性内切酶 c、平末端连接 -AAGCCCGGGTCG- -GGAGGTTAACCT- -TTCGGGCCCAGC- -CCTCCAATTGGA- SmaI酶切 AAGCCC-OH P-GGGTCG- -GGAGGTT-OH P-AACCT- TTCGGG-P OH-CCCAGC- -CCTCCAA-P OH-TTGGA- 混合退火 OH P -GGAGGTT GGGTCG- -CC TCCAA CCCAGC 二、限制性内切酶 三、其他常用的工具酶 （一）DNA聚合酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)： 具有三种酶活性 a、5 3DNA聚合酶活性 CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGA b、3 5 外切酶活性 CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCG GCG Mg2+ dNTP GCG c、5 3外切酶活性 CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAG GCGTAATC Mg2+ GCGTAATC 2、Klenow片段 三、其他常用的工具酶 3、噬菌体DNA聚合酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可对3突出端 的DNA分子进行末端标记。切除3突出端，产生 3凹端。 CTGCCTGCA T4DNA CTG CTGCC GACGG 32P GACGG GACGG 4、Tag DNA聚合酶 是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具 有5 3聚合酶活性，该酶最适反应温度为 7580 0C，主要用途是进行PCR反应。 5、逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） 主要作用是将mRNA反转录成cDNA 三、其他常用的工具酶 （二）T4噬菌体DNA连接酶 该酶的作用是一个DNA片段的5- P与另一DNA片段的3- OH连接成磷酸二酯键。 ACG-OH P-AATTCGT TACTTAA-P OH-GCA -ACGAATTCGT- -TGCTTAAGCA 三、其他常用的工具酶 （三）碱性磷酸酶 其作用是去除DNA、RNA的5磷酸根（ 5-P）， 以防自身环化；另外在用32P标记5末端前，可先 用其去除DNA或RNA上的5- P。 （四）核酸酶 S1核酸酶： 主要用于去除DNA片段粘末端而产生平端； 打开cDNA中发夹结构，使其成平端。 核糖核酸酶（RNaseA)：在质粒提取时降解RNA； 从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。 三、其他常用的工具酶 四、常用的载体 1、质粒载体 2、噬菌体载体 3、考斯质粒（粘性质粒，cosmid） 理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： 能在宿主细胞中自主复制。 容易进入宿主细胞。 容易插入外来核酸片段。 容易从宿主细胞中分离纯化， 便于重组操作。 容易被识别筛选。 四、常用的载体 1、质粒载体 质粒（plasmid）是存在于细菌中独立于染色体 而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子 （Covalently closed Circular DNA, ccc DNA） (1) 质粒的生物学基本特性 自主复制性：携带有自己的复制起始区（ori） 它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。 四、常用的载体 不相容性：不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞 争，拷贝数多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，子 细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中 只能有一种长期稳定地留在细胞中。 稳定性：质粒在宿主细胞中保持着一定的考贝数 寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制 表现型：不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等 。 四、常用的载体 复制类型 质粒在细胞内的复制是受到一定控制的，按其所受控制 的程度可分为两类：严紧型和松弛型。 严紧型质粒的复制受到严格的控制，每个细胞中的数量只有12个 ，它们似乎与染色体的复制受相同因素的控制，在一定的细胞周期 内复制；染色体不复制时，质粒也不复制。 松弛型质粒的复制不受严格的控制，在整个细胞生长周期中可以随 时复制。当用药物抑制了染色体的复制后，它们可以照样复制，显 示出与染色体复制受不同因素的控制，因此它们在细胞中可以有较 多的数量，一般可达10余个甚至更多，如ColE1质粒。 质粒复制控制的类型，有时是和它存在的细胞有关，如某些R质粒 在大肠杆菌中复制是严紧型，而在变形杆菌中则是松弛型。 四、常用的载体 （2）质粒DNA的构型 SC(CCC covalently close circular DNA )构型:两条 核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋。 OC(open circularDNA)构型:两条链中只有一条保持着完整 的环形结构，另一条链出现缺口，称之为开环DNA。 L(linear构型:DNA的双链均发生断裂而形成线性分 子。 四、常用的载体 四、常用的载体 四、常用的载体 (3)质粒的命名原则 用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大 写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名 称。后面的数字是构建质粒的编号。如： pUC18和pBR322。 （4）质粒的构建 加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。 增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。 改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。 加装特殊的基因元件。 （5） 质粒的分类 多拷贝质粒：用于扩增外源基因。 测序质粒：加装测定顺序所必需的序列。 整合质粒：装有整合促进基因及整合特异序列。 穿梭质粒：能在两种不同的受体细胞中复制。 表达质粒：装有强的启动基因。 探针质粒： 筛选克隆或寻找基因元件。 四、常用的载体 (6) 实验室常用质粒 pBR322 4.3kb多拷贝松弛型，内含一个（Ori)、一个抗氨 苄青霉素（Ampr ）和一个抗四环素（Tetr ）标 记基因。 四、常用的载体 pUC18/19 2.8kb，含一个复制起点（Ori)、一个抗性基因Ampr ，一 个改造的大肠杆菌-半乳糖苷酶基因lacZ/,在lacZ/ 基因中有 一段人工合成的含多种内切酶的单一切点，在此位点上插入 外源DNA都能灭活下游lacZ/基因。 四、常用的载体 四、常用的载体 （7）质粒的制备 I. 碱裂解法 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体 离心取上清液，灭活去除蛋白质及核酸酶 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 无DNase的RNase处理残余RNA 四、常用的载体 II、沸水浴法 a、菌体浮在含有EDTA的缓冲液中 b、加溶菌酶破细胞壁 c、放入沸水浴中煮40秒 d、离心，用无菌牙签挑去沉淀物 e、乙醇异丙醇沉淀 四、常用的载体 四、常用的载体 2、噬菌体载体 噬菌体的繁殖方式有两种： 溶菌性方式（lytic ）： DNA先经多次复制合成许 多子代DNA，再装配成许 多子代的噬菌体，最后裂菌 ，释放出许多新的噬菌体。 四、常用的载体 四、常用的载体 溶原性方式（lysogenic ）：进入细菌的DNA 可整合细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA 复制，传给细菌后代。 (1) 噬菌体的分子生物学 噬菌体是由外壳蛋白和DNA组成。 -DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12 核苷酸的互补单链，称为cos区。 左边是外壳蛋白的基因；右边是负责裂解宿主 细胞基因、DNA自主复制以及调控基因；中间是负 责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因。 四、常用的载体 （2）DNA载体的构建 a、缩短长度 野生型DNA包装的上限为50.5kb，本身长度为 48.5kb，插入片段至多为2.0kb，如果将其缩短 便能够提高装载量。 四、常用的载体 I、插入