细胞免疫功能检测方法课件

细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用 指导老师： 常维山教授 柴家前副教授 刘永庆教授 报告人：李梅 ELISPOT是什么？ ELISPOT ： 全名为酶联免疫斑点检测。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术， 能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分 泌情况 原理可概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌 的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现 出来（Sedgwick JD 2005）。 ELISPOT检测的优点 灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有 一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测 出来。灵敏度高于ELISA 。 单细胞水平：ELISPOT 检测的是单个活细 胞的分泌。 操作简便：不需专门的实验仪器设备。可 按照标准化的实验操作，可以同时处理数 百个样品（Kalyuzhny AE 2005）。 ELISPOT的流程 底板与捕捉抗体的包被 底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody ）。 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被抗 体，包被量通常在1-2g/mL（1.25ug/ml ） 。 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水 纸上扣干后，用完全培养基37封闭2h。 倾倒封闭液， 加入检测细胞进行细胞培养。 标准曲线的建立和蛋白含量的确定 olin酚法（20ug/ml- 500mg/ml） NDV浓缩抗原作1:25稀 释，在650nm波长下比色 ，吸光度为0.264,带入 回归方程式y=629.1x， 求得蛋白含量为166g /mL，所以NDV浓缩抗原 的蛋白浓度为4150g /mL。 脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响 培养时间对斑点数的影响 NDV抗原浓度对斑点数的影响 影响试验效果的其他因素 细胞是否具有活力是 试验成功进行的先决 条件，凡是活力高功 能保持完好的细胞， ELISPOT检测时必定 背景干净，阴性对照 斑点少，而试验组斑 点圆润鲜亮。 在ELISPOT板的移动过程中也 要避免ELISPOT板的摇动，否 则会造成斑点的分布不均。 在细胞培养完成之前一定要 进行严格的无菌操作，试验 过程中各步的洗涤工作一定 要充分。否则会造成背景的 不清晰，针尖样杂斑的增多 。 ELISPOT应用实例 跟据间接ELISA结果判定标准（P/N2.1），由表1OD450值可以看出， 小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22 ，抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体 的IFN-水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高 值，此时分泌IFN-脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫 小鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳 性检出的前期IFN-的分泌降至最低水平。 应用及展望 白细胞中能够分泌IFN-的细胞为TH2和CTL细胞, 活化条件对细胞内免疫染色IFN和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细 胞的影响 Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细胞 ，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、有 无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环境 ，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2细胞 ）。 老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IFN与IL4的变化 疫苗研究开发：ELISPOT 检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的 指标之一（Harrop R et. al., 2004）。对于某些持续性感染疾病，疫 苗的细胞免疫保护效果甚至居于主要地位 nIL-4可以促进B细胞分化、增殖,在IgE诱导合成 中起关键作用4,诱导气道上皮细胞产生内毒 素,趋化嗜酸性粒细胞,加重气道炎症5. IFN- 与IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA 转录水平,并抑制由IL-4诱导的B细胞合成 IgE6. nTh1/Th2亚群的失衡,与许多人类疾病有关,多 数认为,支气管哮喘中,Th2亚群及所属细胞因 子占优势,在该病的发生发展中作用重要2,4. 由于CD4+分子 B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影 响的研究陈良恩中国人民解放军军事医学科学院 2007-08-242007博士 突变型乙型肝炎病毒前C-C DNA疫苗的基础研究张 敏中国人民解放军军医进修学院2007-07-052007博士 欢迎各位老师同学提出宝贵意见！ ELISPOT与其他细胞免疫检测方法的 比较 n当特异性抗原和T细胞结合后激活细胞释放出 IFN-Y，IFN-YELISPOT可灵敏的检测出T细胞 释出的IFN-Y，该方法己被用于多种CTL的检 测。Yang