医学课件分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用

分子技术在肿瘤靶向药物 治疗的应用 中南大学病理学系 湘雅医院病理科 周建华 肿瘤靶向治疗 （Target therapy of cancer ） n依据已知肿瘤发生的异常分子和基因， 设计和研发针对这些特定的分子和靶点 药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法 ； n靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶 基因变异类存在与否和变异类型； n个体化治疗的雏形。 荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization，FISH ）技术 简介 nFISH = Fluorescence In Situ Hybridization n利用荧光标记的DNA探针检测组织或细胞 内与其互补的DNA片段 n应用：遗传病诊断 血液肿瘤 实体瘤 n样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、 骨髓、体液及各种肿瘤组织等 用已知的标记单链核酸为探 针，按照碱基互补的原则， 与待检材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形成可被 检测的杂交双链核酸。由于 DNA分子在染色体上是沿着 染色体纵轴呈线性排列，因 而可以探针直接与染色体进 行杂交从而将特定的基因在 染色体上定位 荧光标 记探针 探针变性 样本DNA变性 杂交 工作原理 FISH检测染色体易位（Translocation）在 淋巴瘤分型中的应用 FISH技术在淋巴造血系统 肿瘤中的应用 检测技术特点 n不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同 n优点 l适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本 ； l适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织 。 n必须结合组织形态学和免疫组化结果作最 后诊断！ FISH基因检测在淋巴瘤的应用 淋巴瘤FISH检测基因临床应用 套细胞淋巴瘤IGH/CCND1融合基因辅助诊断 滤泡性淋巴瘤BCL2/IGH融合基因辅助诊断、判断预后 弥漫性大B细胞淋 巴瘤 BCL6基因断裂重组辅助诊断、判断预后 伯基特淋巴瘤C-MYC基因断裂重组辅助诊断 粘膜相关淋巴组织 淋巴瘤 MALTI基因断裂辅助诊断 胃粘膜相关淋巴组 织淋巴瘤 API2-MALTI融合基因指导治疗 弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL） 按免疫组化亚型分为 CD5阳性DLBCL 生发中心B细胞样变型(GCB)、 非生发中心B细胞样变型(non-GCB) 3类 可根据CD10、BCL6、MUM1的表达区分生发中 心B细胞样变型、非生发中心B细胞样变型。 30%瘤细胞表达CD10或CD10(-)、BCL-6(+)、 MUM-1(-)诊断为GCB; 其他病例则为non-GCB。 BCL6基因断裂-辅助诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤 BCL6基因断裂重排-判断预后 目前研究确定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。 一项针对102名DLBCL患者的BCL6重排情况及其与预后关系的研 究显示，BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比 率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好。 BCL6 基因断裂与弥漫性大B细胞淋巴瘤 Offit, K. N Engl J Med, 1994. 331(2): p. 74-80. 结果判读 IGH/CCND1融合基因可见于95%的套细胞淋 巴瘤，是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤鉴别 的重要指标。 uIGH/CCND1融合基因-辅助诊断套细胞淋巴瘤。 IGH/CCND1融合基因与套细胞淋巴瘤 l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。 l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。 API2/MALT1基因检测试剂盒 探针：GLP API2/GLP MALT1 凋亡抑制因子2基因（apoptosis inhibitor-2,API2）,位于11号染色体; 粘膜相关淋巴组织基因（Mucosa-associated lymphoid tissue 1 ,MALT1 ） ，位于18号染色体。 API2基因与MALT1基因的融合导致凋亡抑制的增加 ，引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势。 u API2/MALT1融合基因的检测可以指导抗HP 治疗 胃MALT淋巴瘤与幽门螺旋杆菌（HP）感染导 致的慢性胃炎有关，MALT1/API2融合基因阴性的 患者抗HP治疗有效，阳性患者抗HP治疗无效。 API2/MALT1融合基因检测意义 l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。 l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。 BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患者中，检测 BCL2/IGH基因重排可以辅助诊断FL。 BCL2/IGH阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性 者只有54%； 阴性者3年疾病无进展为87.5%，而 阳性者只有13%。 BCL2/IGH融合基因与滤泡性淋巴瘤 n BCL2/IGH融合基因-辅助诊断滤泡性淋巴瘤 n BCL2/IGH融合基因-判断预后 l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。 l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。 结果判读-阳性结果 结果判读-阳性结果 约80%的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14) （q24;q32 ）； 约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)； 约5%发生t(8；22)（q24;q11）。 染色体易位导致C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋 巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅 助诊断。 C-MYC基因断裂与伯基特淋巴瘤 u 辅助诊断伯基特淋巴瘤 结果判读-阳性结果 FISH技术在乳腺癌靶向治疗应用 乳腺癌 Her-2基因 l 致癌基因：Her-2基因； l 位点：17q11.2-q12； l 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； l 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的扩 增； l HER-2基因扩增是决定Herceptin 治疗是否有效的关键性指标。 lHER2扩增的乳腺癌更具有侵袭性生 长能力。 乳腺癌Her-2基因及蛋白检测 Cerb-B-2 :3+ 完全强膜阳性细胞30% 2+,1 +,- FISH检测是否有基因扩增 Her2基因 检测流程 石蜡组织标本 IHC检测 再用FISH 方法检测 1+3+2+ + Herceptin治疗 + 再用FISH 方法检测 Herceptin治疗 FISH检测 + 再用FISH 方法检测 + A. 无须计数的大簇团信 号（高度扩增） B. 颗粒状信号（R10，高度扩增 ） C. 须计数的颗粒状信 号（R=3.5，低度扩增 ） A C B Her-2基因扩增状况 30%的肿瘤细 胞全部的细胞膜 高强度着色 免疫组化（3+）与FISH对比 40100 浸润性导管癌级 IHC：+ FISH：呈簇团状高度扩增 100 免疫组化（）与FISH扩增阳性 浸润性导管癌级 IHC： FISH：呈簇状扩增 肿瘤细胞不着色 40 100 基因突变检测方法 1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage) 2.变性梯度凝胶电泳(DGGE) 3. 杂合双链分析法(HA) 4. 化学切割错配(CCM) 5.碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI) 6.酶促切割错配(Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7.单链构象多态性 (Single-Strand Conformation) 8.切割片段长度多态性 9.DNA测序(Sequencing) 10.双脱氧指纹图谱法(Dideoxy Finger-printing, ddF) 11.错配接合蛋白检测 12.蛋白截短测试（protein truncation test） 方法 13.变性的高效液相色谱检测(Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC) 14.DNA芯片技术(DNAchip) 15.等位基因特异性扩增 16.等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele- Specific Oligonucleotide,ASO) 17.引物延伸检测(Primer Extension,PEX) 18.寡核苷酸连接检测(Oligonucleotide Ligation Assay,OLA) 19.限制性片段分析(Restriction Fragment Analysis） 20.突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR） 21.蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions amplification refractory mutation system） 肺癌组织EGFR基因扩增和 突变检测及其临床意义 研究背景 n研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗 效果非常显著。 n存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼 的治疗敏感。 n存在EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶 点药物更为敏感。 n检测大肠癌有无EGFR过度表达，只要1%的癌 细胞的胞膜强阳性染色即判断为3+，可作为应 用西妥昔单抗的指征。 n FISH检测EGFR基因扩增 l标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺） 冰冻组织 胸、腹水沉渣细胞 l 探针类型：GLP EGFR / CSP7 n 定量PCR检测EGFR基因突变分型 l 突变类型： 19 exon （2235-2249位点）15bp缺失突变 19 exon （2240-2257位点）18bp缺失突 变 19 exon （2240-2251位点）12bp缺失突 变 21 exon 2573位点TG碱基置换突变 21 exon 2582位点TG碱基置换突变 EGFR基因变异检测 双体性 三体性 多体性扩 增 EGFR基 因 FISH 检 测 状 况 肺 癌 石 蜡 FQ-PCR分型技术检测EGFR突变 存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图 71例肺癌组织中检测出6例突变样本 FQ-PCR 检测15bp缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为红色阈值线以上的扩增曲线即为 阳性标本的扩增曲线，按荧光信阳性标本的扩增曲线，按荧光信 号值的高低依次为号值的高低依次为 9 9号、号、1212号、号、 1313号、号、5555号、号、3838号和号和3333号标本号标本 15bp缺失突变型DNA的测序图 sensesense antisenseantisense 红色阈值线以上的扩增曲线即红色阈值线以上的扩增曲线即 为阳性标本的扩增曲线，按荧为阳性标本的扩增曲线，按荧 光信号值的高低依次为光信号值的高低依次为2 2号、号、 3636号、和号、和4040号标本号标本 FQ-PCR 检测18bp缺失阳性病例结果 目前K-RAS突变检测常用技术 方法 n直接测序 n焦磷酸测序 n高分辨率熔解曲线 nPCR-RFLP n芯片 n杂交 nReal-Time PCR 肿瘤组织的确认和筛选 显微切割肿瘤 提取DNA 相应的PCR反应或杂交 相关的分析和检测 K-ras突变检测基本流程图 直接测序(Direct Sequencing) PCR扩增后产物直接测序 n双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法 ) DNA 片段是荧光标记的，这些 片段经过平板胶电泳或毛细管电 泳得到分离，荧光分子被激发而 发光，发出的光信号被检测系统 检测 K-ras突变检测结果 疗效预测标志物与预后判断标志物 n疗效预测标志物： 能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物 nKRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗 n预后判断标志物： 在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标 记物 n18号染色体长臂（18q）缺失 n某些分子标志物兼具两种作用 n胸腺嘧啶合成酶（Thymidylate synthase） EGFR 作为预后因子的价值 EGFR expression correlates with poor prognosis DFS = Disease-free survival; OS = overall survival Tumor typePrognosisSurvival Risk of metastasis References Colorectal Poor Poor - Decreased OS Increased - Hemming (1992) Mayer, De Jong (1992) Head 26:374379MAPK = mitogen-activated protein kinase lK-ras基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。 lK-ras基因突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反 而徒增不良反应危险和治疗费用； 抗EGFR治疗和K-ras突变相互排斥 K-ras基因抗EGFR治疗关系密切 n2009年7月FDA批准了对西妥昔单抗和帕尼 单抗说明书标签的修改： 结直肠癌分子靶向治疗药物 注明KRAS基因突变的结直肠癌患者不推荐这 使用这两种用药物。 l K-ras基因突变: 20-60%结直肠癌 l K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原 发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一致 K-ras基因突变 NCCN临床实践指南指南明确指出所有转移性结直肠癌患者 都应检测K-ras基因状态。 美国美国临床肿瘤学会(ASCO)推荐把K-ras基因突变检测作为 结直肠癌患者接受EGFR单抗治疗的预测指标。 欧盟药品审评管理局规定：cetuximab 及panitumumab 用于mCRC的治疗前，患者必须确定为K-ras野生型。 K-ras与结直肠癌治疗 结直肠癌（CRC）缺乏EGFR基因突变 n对爱