生物技术制药抗体制药ppt课件

第四章 抗 体 制 药 第一节 概述 1890年Behring和北里柴三郎 发现白喉抗毒素,建立了血清疗法, 开创了抗体制药。 1937年Tiselius用电泳法将 血清蛋白分离为白蛋白、 球蛋白，并证明抗体活性主要 存在于球蛋白组分。 抗体是指能与相应抗原特异 性结合具有免疫功能的球蛋白 。 抗体的产生：机体免疫系统 受抗原刺激后，B淋巴细胞被活 化增殖和分化为浆细胞，由浆 细胞合成和分泌的球蛋白。 20世纪60年代发现多发性骨髓 瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性 疾病。病人血清中出现同抗体结构 类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋 白（immunoglobulin，Ig）。所以 Ig是化学结构的概念，而抗体是生 物学功能的概念。 多克隆抗体：病原微生 物含有多种抗原决定簇的抗 原物质，因此这些抗体制剂 也是多种抗体的混合物，故 称多克隆抗体。 1975年Kohler和Milstein首先 利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 单克隆抗体（monoclonal antibody McAb）。 单克隆抗体具有高度特异性、 均一性、来源稳定、可大量生产等 特点，为抗体制备和应用提供了全 新的手段，还促进了基础和临床医 学的发展。 单克隆抗体作为抗体制剂， 在临床上主要用与疾病的诊断和 治疗。 单克隆抗体检测与某些疾病 有关的抗原，辅助临床诊断。用 放射性核素标记单克隆抗体进行 肿瘤显像，做免疫定位诊断。 单克隆抗体用于临床治疗， CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂 对器官移植免疫排斥有抑制作 用。 以单克隆抗体作为载体的药 物对肿瘤进行定向治疗。 第二节 单克隆抗体 单克隆抗体是将抗体产生细 胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤 细胞相融合，通过有限稀释法及 克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的 单克隆细胞系而产生的。 一、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首 先要制备用于免疫的适当抗原，再用 抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛 选、克隆化。 为使杂交瘤细胞稳定，免疫 动物和骨髓瘤细胞供体同一品系 动物进行免疫。 目前常用的骨髓瘤细胞系多 来自BALB/c小鼠和 LOU大鼠，因 此免疫动物也采用相应的品系。 免疫的方法采用体内免疫法和 体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强 、抗原量较多时应用，一般用812 周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原 ）的免疫原性强，可不加佐剂，直 接注入腹腔10个细胞进行初次免疫 ，间隔13周，再追加免疫12次 。 7 可溶性抗原按每只小鼠10100g 抗原与福氏完全佐剂等量混合后注 入腹腔内，进行初次免疫，间隔 24周，再用不加佐剂原抗原追加 免疫12次。 一般再采脾细胞前3日由静脉注射最 后一次抗原。刺激B细胞分裂。 脾内免疫法即在麻醉下直接将 0.10.2ml抗原注入脾脏进行 免疫。细胞抗原需105个，可溶 性抗原需10g。 体外免疫法用于不能采用体 内免疫的情况下，如制备人源性 单克隆抗体；免疫源性极弱，易 引起免疫抑制。 优点：需抗源量少，免疫期短， 干扰因素少。 体外免疫法：用48周龄BALB/c 小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加 入适当抗原使其浓度达0.5 5g/ml,在5% CO 37 C 下培养4 5天,再分离脾细胞,进行细胞融 合。 o 2 o 二、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养 细胞融合的方法： 脾细胞（110 ） 骨髓瘤细胞（210 ）混合 聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用 培养液将融合液缓慢稀释。 8 7 用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有 融合率高，自身不分泌抗体，所产生 的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期 稳定。 PEG相对分子量4000，浓度为50% 二甲基亚砜增加融合率。 细胞融合后可产生多种融合。 脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞。 选择性培养: 培养基 为HAT培养液。 次黄嘌呤(H) 氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。 A阻断DNA合成。 三、筛选阳性克隆与克隆化 筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫 技术等。 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获 得细胞集团的整个培养过程。 ELISA用于破伤风抗体的筛选 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是 鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力 。 单抗进行Ig类和亚类鉴定： 用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行 免疫扩散或ELISA鉴定。 亲和力、特异性、纯度、分子量测定。 五、单克隆抗体的大量制备 体外培养法可获的10g/ml抗体 体内诱生法可获的520mg/ml抗体 用BALB/c小鼠。 降植烷 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清。 六、单克隆抗体的纯化 依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同 的纯化方法。 体内诱生法单克隆抗体的纯化方法： 1离心 取上清，超滤，盐析。 2分离 凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化 。阴离子交换层析IgG单抗纯化。 亲和层析 IgG单抗纯化。 第三节 鼠源性单克隆抗体 的改造 杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产 生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源 性的单抗进行基因加工和改造。 目的：降低免疫源性；降低相对分 子量。 人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分 子抗体。 Ig分子结构 Ig分子的基因结构 一、人鼠嵌合抗体 抗原抗体结合功能抗体可变区（V） 同种性免疫源性抗体稳定区（C） 在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可 变区基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠 嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨 髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗 体。 二、改形抗体（CDR移植抗体） Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区 域是H和L链V区中的互补决定区（CDR 区），而不是整个可变区。 H和L链各 有三个CDR，其它部分称框架区。 用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子 中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有 鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除 免疫源性。 三、小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的 V区片段，相对分子量为原抗体的1/80 1/3。即保留CDR区，而Ig 分子中的 C区不表达。 小分子抗体类型有： Fab片段抗体 Fv抗体 单链抗体 单域抗体 最小识别单位 单链抗体的优点： 可去除非特异性反应的竞争性表面 蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。 易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓 度。 免疫源性小，可消除人抗鼠的排异 反应。 单链抗体大多在大肠杆菌中 表达，有三种形式： 直接在细胞质中表达； 与其它菌体融合表达融合 蛋白； 分泌表达具有功能的单链 抗体。 四、双功能抗体 双功能抗体就是双特性抗体。它是一种 非