tbi和环磷酰胺选择性去除同种异基因反应 供者淋巴细胞的研究(1)

TBITBI 和环磷酰胺选择性去除同种异基因和环磷酰胺选择性去除同种异基因 反应反应 供者淋巴细胞的研究供者淋巴细胞的研究(1)(1) 作者：陈宝安，董伟民,丁家华，孙雪梅，邓晓静,张 琰，毕延智 赵刚,高冲，孙耘玉，王骏，程坚， SchmittM2，SchmittA2 【摘要】 本研究用全身照射和环磷酰胺（CY）选 择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞,为预防移植物抗 宿主病的发生探索新的手段。以 F1 雌性小鼠（H2d/b） 为受鼠，于第 0 天接受亚致死量的 60Co 射线全身照射， 总剂量为 4Gy，第 1 天接种 P388D1 白血病细胞，第 2 天输 注由 C57BL6 雄性小鼠（H2b）为供鼠提供的 MHC 不匹 配的供者脾淋巴细胞，在造血干细胞移植前诱导移植物抗 白血病效应（GVL） 。第 6 天腹腔注射环磷酰胺（CY） 200mg/kg 或再次 TBI9Gy，选择性去除同种异基因反应供者 淋巴细胞，第 7 天输注 F1 雄性小鼠（H2d/b）提供的骨 髓造血干细胞。结果显示：以 CY 和 TBI 选择性去除同种异 基因反应供者淋巴细胞组的小鼠无白血病和 GVHD 的发生， 生存期超过了 210 天，于移植后第 21 天出现完全供者嵌合， 然后嵌合率下降，第 90 天表现为混合嵌合体（MC） 。对照 组的小鼠出现了白血病和 GVHD，出血、感染明显，生存期 短，为 20-36 天（P 【关键词】同种异基因造血干细胞 移植；同种异基因反应供者淋巴细胞；移植物抗白血病效 应；移植物抗宿主病；全身照射；环磷酰胺 SelectiveEliminationofAlloreactiveDonorLymphocytesb yUsingTBIandCyclophosphamide AbstractThisstudywasaimedtoinvestigateanewmethodofa voidinggraftvshostdiseasethroughselectiveelimin ationofalloreactivedonorlymphocytesbyusingtotalbody irradiationandcyclophosphamide.FemaleF1miceasrecipi entsreceived60CoraysublethalTBIof4Gyonday0follo wedbybeinginoculatedwithP388D1leukemiacelllineonday 1,injectionofallogeneicsplenocytesfromC57BL6malem ice（H2b） wascarriedoutforinductionofgraftvsleukemiaeffec tpriortostemcelltransplantation,intraperitoneallyin jectionofcyclophosphamideandTBIwasgivenonday6.Oneda ylater,treatedmicewererescuedwithbonemarrowhematopo ieticstemcellsfromF1malemice（H2d/b）. Theresultsshowedthatrecipientshadnooccurrenceofleuk emiaandGVHDthroughselectiveeliminationofalloreactiv edonorlymphocytesbyCyandTBI,survivedmorethan210days ，thecompletedonorchimerismoccuredonday21aftertra nsplantation.Theratioofchimerismdescendedsubsequent ly,butstilldisplayedmixedchimerismat90days.Contro lmicediedofGVHD,leukemia or otherdeathrelatedtr ansplantationwithin20to36days（P Keywordsallogeneichematopoieticstemcelltransplantat ion；alloreactivedonorlymphocyte；graftversusle ukemia；graftversushostdisease;totalbodyirradia tion;cyclophosphamide 异基因外周血造血干细胞移植是治疗恶性血液病和某 些实体瘤的重要手段，移植物抗宿主病是异基因外周血造 血干细胞移植主要的并发症和死亡原因。目前预防 GVHD 的 措施主要是在移植前后应用细胞毒药物和免疫抑制剂，虽 可明显降低 GVHD 的发生，但也减弱了移植物抗白血病效应 （GVL）或移植物抗肿瘤效应（GVT） ，从而导致白血病或肿 瘤的复发。本研究探讨造血干细胞移植前诱导移植物抗白 血病效应。我们在造血干细胞移植前输注不相匹配的供者 淋巴细胞,然后再用全身照射（TBI）和环磷酰胺（CY）选 择性地去除同种异基因反应的供者淋巴细胞来预防移植物 抗宿主病的发生。 白血病细胞株 小鼠急性淋巴细胞白血病细胞系3881 购自中国科 学院上海细胞生物学研究所细胞库，然后将其置于 RPMI1640 培养液进行传代培养,每 3-4 天传代 1 次。培养条 件:5%2、饱和湿度、37。 动物 受鼠为清洁级 F1 雌性小鼠（H2d/b） ，10-12 周龄， 体重g；供鼠为清洁级雄性 C57BL/6 小鼠和 F1 雄性小鼠 （H2d/b） ，由扬州大学畜牧兽医学院提供，均饲养于东 南大学医学院 SPF 级动物房内，饲料及垫料均经辐照消毒， 饮用高压消毒无菌水。 试剂及器材 环磷酰胺（CY，200 毫克/支）为上海华联制药有限公 司产品，TRIzoLRNA 抽提试剂盒为 Invitrogen 公司产品， 60Co 放疗机（中国核动力研究设计院研制的 GWGT80 型 60Co 远距离治疗机） ，由南京市第二人民医院提供帮助。 移植细胞的准备 C57BL6 雄性（H2b）供鼠,颈椎脱位法处死,75%的 乙醇中浸泡 5 分钟,无菌条件下取出脾脏,置于 200 目金属 过滤网上,用研磨棒轻轻按压,用 RPMI1640 培养液冲洗,细 胞悬液洗涤 3 次,计数,调整浓度为 5107/ml。F1 雄性供 鼠（H2d/b）同样在无菌条件下剥离股骨及胫骨,剪去两 端,用 RPMI1640 培养液冲出骨髓,制成细胞悬液,洗涤 3 次, 计数,调整细胞浓度为 1108/ml； 白血病细胞接种、脾淋巴细胞输注和骨髓移植 F1 雌性受鼠（H2d/b）,移植前 5 天开始饮用含红霉 素 250mg/L、庆大霉素 320mg/L 的冷却开水。第 0 天置于清 洁级包装的塑料盒内接受 60Co 射线 Gy 全身照射，照射 距离 80cm,照射时均为立式体位,剂量率 500cGy/min。第 1 天接种 P388D1 白血病细胞株 ml,含细胞数107,第 2 天输 注由 C57BL6 雄性小鼠（H2b）为供鼠提供的 MHC 不相 匹