生物化学第三章核酸化学ppt课件

第三章 核酸化学 1. 核酸的化学组成结构及其性质 2. 核酸的测定方法 3. 核酸的研究技术 重点： 1. RNA. DNA一级结构的测定原理与方法 2.双螺旋结构要点，三叶草结构要点 3. 核酸研究的常用技术及应用 4. 核酸含量的测定原理与方法 难点： 1. DNA一级结构测定的原理与方法 2. 核苷酸的两性离解 3. 双螺旋结构的要点 教学目的 1868年，F. Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质 ，即现在被称为核酸的物质。 and 可分离 核酸的种类和分布 核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA） 98核中（染色体） 真核 线粒体（mtDNA） 核外 质粒（plasmid） 叶绿体（ctDNA） DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid） 病毒：DNA病毒 mRNA (5%) 真核 tRNA (10-15%) rRNA（80%） SnRNA(核内） sRNA SnoRNA(核仁） RNA mRNA ScRNA(胞内) 原核 tRNA rRNA 病毒：RNA病毒 核酸的功能 1、DNA是遗传信息的载体 2、RNA的功能 参与遗传与进化 参与蛋白质的生物合成 参与RNA转录后的加工修饰 参与基因表达调节 催化等 第一节 核酸的组成成分 一.元素组成 C H O N P(9%-9.9%) 核酸 核苷酸 核苷 磷酸 碱基 戊糖 嘌呤 嘧啶 核糖 脱氧核糖 核酸酶 核苷酸酶 核苷酶 鸟嘌呤 腺嘌呤 尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶 RNA:P-9%,DNA:P-9.9% 核酸的组成单位：核苷酸 核酸的组成成分：碱基，戊糖，磷酸 二. 组成成分及组成单位 （一）、戊糖 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖； RNA所含的糖则为-D-核糖。 RiboseRiboseDeoxyriboseDeoxyribose （二）、碱基（二）、碱基 1. 1. 嘌呤（嘌呤（PurinePurine）碱碱 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 9 9 7 7 8 8 腺嘌Adenine A A 鸟嘌呤guanine GG 嘌呤（嘌呤（PurinePurine） 2. 2. 嘧啶（嘧啶（PyrimidinePyrimidine）碱碱 嘧啶（嘧啶（PyrimidinePyrimidine） 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 尿嘧啶uracil U U 胞嘧啶Cytidine C C T T H3C 胸腺嘧啶Thy ( (三三) )、核苷（、核苷（nucleosidenucleoside） 核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键 11 2233 44 55 (OH) 11 2233 44 55 (OH) 腺嘌呤脱氧核苷鸟嘌呤脱氧核苷胸腺嘧啶脱氧核苷胞嘧啶脱氧核苷 HHHH CH3 （四）、核苷酸（nucleotide） H （五）.核苷酸衍生物 1.继续磷酸化 AMP ADP ATP 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多， 大部分是上述碱基的甲基化产物。 2.稀有碱基 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 OH OH NH2 CH3 + 7-甲基鸟苷 m7G 取代核苷的表示方式 5 5 OH 假尿苷（假尿苷（） 次黄苷（肌苷）I 黄嘌呤核苷 X 二氢尿嘧啶核苷 D 11 2233 44 55 OH OH OH 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 OH OH 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 OH OH OH 3.环化磷酸化 l cAMPl cGMP 4.肌苷酸及鸟苷酸(强力味精) IMP GMP 第二节、RNA的分子结构 一、 RNA的一级结构 （一）连接方式 5 5 3 3 5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU T 5 3 OH U 5 3 OH l5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表 示） l多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须 注明它的方向是53或是35。 多聚核苷酸的表示方式 DNA RNA (二)、RNA的降解 1、RNA的化学降解 n碱降解：RNA用稀碱降解产物为2-核苷酸和3-核苷酸混合物 。DNA抗碱(高温不抗碱) n酸降解：水解速度 糖苷键脂键 嘌呤糖苷键 嘧啶糖苷键 脱氧核糖糖苷键核糖糖苷键 n在低温的酸性条件下DNA，RNA则稳定 2.酶法降解 核酸酶有:外切酶，内切酶和磷酸酯酶 牛胰RNaseI 产物：3-嘧啶核苷酸（结尾） 内切酶 RNase T1 产物：3-鸟嘌呤核苷酸（结尾） RNase U2 产物：3-嘌呤核苷酸（结尾） SPDase (牛脾) 5-端开始，产物：3-核苷酸 外切酶 VPDase (蛇毒)3-端开始，产物：5-核苷酸 磷酸单酯酶（PNase） 5-磷酸 （一）RNA的二级结构 二.RNA的高级结构 占RNA总量的15 一种氨基酸对应最少一种RNA 分子量25000左右，大约由7090 个核苷酸组成，沉降系数为4S左右 。 l分子中含有较多的修饰成分。 l3-末端都具有CpCpAOH的结构 。 1.特点 2.三叶草结构要点 （二）tRNA的三级结构 第三节 DNA的分子结构 一、一、DNADNA的的一级结构及测定 1.加减法 ATGCTG35 53 ATGCTG35 5TACGAC TACGA TAC TACG TA T DNA聚合酶 4种dNTP(一种为-32P-标记） 模板 引物 ATGCTG35 5TACGAC TACGA TAC TACG TA T +A -T-C-G-A +T+C +G TACGA TA TACG TACGAC TAC TTACG T TACTACGA TA +A +G +C-G+T-A-C -T 电 泳 方 向 读 带 方 向 新合成链的5 3 2.双脱氧法 ATGCTG35 53 DNA聚合酶 4种dNTP(一种为-32P-标记） +ddATP+ddTTP+ddCTP+ddGTP TACGddA TddA TACGAddC TAddC TACddGddT 3 TACGAC TACGA TAC TACG TA T +ddA+ddT+ddC+ddG dNTPddNTP 的比例最好为 1100 3.化学修饰法 修饰及断裂条件 碱基修饰试剂 断裂条件 A+G G T+C C 甲酸 硫酸二甲酯 肼 肼+盐 哌啶 加热 哌啶 哌啶 被测定链的5 3 二.DNA的二级结构 2.0 nm 小 沟 大 沟 要点： 1.多核苷酸链的走向 2.螺旋的角度.高度.直径 3.碱基分布及配对规律 4.作用力 （一）双螺旋提出的基础 （二）双螺旋结构要点 双螺旋DNA的结构参数 类类型旋转转方向 结结晶状态态 螺旋直径 （nm） 螺距（ nm） 每转转碱基 对对数目 碱基对间对间 垂直距离 （nm） 碱基旋转转角 度 ADNA BDNA C- DNA zDNA 右75%Na+ 右92%Na + 右66%Li + 左 人工合成 2.0 2.3 1.92 1.8 2.8 3.4 3.1 4.5 11 10 9.3 12 0.255 0.34 0.33 0.27 32.7 36 38 -60 （三）双螺旋的结构类型 （四）左旋DNAZ-DNA 要点 1.左旋锯齿状 2.碱基向外 3.只有小沟 4.12bp，4.56nm （五）.绞链DNA（hing-DNA 即H-DNA 要点 ： 1.三联体碱基配对方式 2.第三链位于大沟中 3.两条链反平行排列 4.酸性PH或负超螺旋张力下 B-DNA H-DNA 三、DNA的三级结构 DNA双螺旋的进一步扭 曲构成三级结构。 正超螺旋 负超螺旋 双链线性DNA（dsDNA） 如真核生物 双链环状DNA（dcDNA） 如细菌、质粒 单链环状DNA（scDNA） 如病毒、噬菌体 单链线性DNA（ssDNA） 如病毒、噬菌体 连环数（linking number）：在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋 绕另一条链缠绕的次数.以“L”表示。 超螺旋数或缠绕数（writhing number）：右手超螺旋为正， 左手超螺旋为负。以“W”表示。 扭转数（twsting number）：DNA分子中的双螺旋数。以“T”表示。 L=T+W 第四节 核酸及核苷酸的性质 一、溶解性 DNA在PH4.2时溶解度最低。 RNA在PH2-2.5时溶解度最低。 1.水溶性 微 溶于水，不溶于有机溶剂,水中溶解度DNA达2%，RNA达4% 2.盐溶性 DNA-蛋白，溶于1mol/L Nacl ，低盐不溶。 RNA-蛋白，溶于0.14mol/L Nacl ，高盐不溶。 3.不同PH的溶解性 二.两性性质 1.腺嘌呤 2.鸟嘌呤: 4.尿嘧啶 胸腺嘧啶 3.胞嘧啶 三、核酸的紫外吸收特性 在核酸分子中，由于 嘌呤碱和嘧啶碱具有 共轭双键体系，因而 具有独特的紫外线吸 收光谱，一般在260nm 左右有最大吸收峰， 可以作为核酸及其组 份定性和定量测定的 依据。 以A260/A280进行定性、 定量 DNA和RNA溶液中加入 溴化乙锭（EB），在 紫外下发出荧光 四、核酸的变性与复性 （一）. 变性 变性:稳定核酸双螺旋次级键断裂 ，空间结构破坏，变成单链结构的 过程。核酸的的一级结构(碱基顺 序)保持不变。 变性表征: 生物活性部分丧失、粘度下降 、浮力密度升高、紫外吸收增加（ 增色效应） 变性因素: pH（11.3或5.0）变性剂（脲、 甲酰胺、甲醛），低离子强度 加热 热变性和Tm : DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此， 通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用 Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含 量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子 中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44 （二）. 核酸的复性 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的 过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得 到部分的恢复，具有减色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA 缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度Tm25 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/ 纯度/ 溶液离子强度 （三）. 核酸的复性与分子杂交 退火 复性 杂交变性 两个不同来源 的DNA分子 第五节 核酸及其组分的分离纯化与测定 一.分离纯化的一般原则 1.防止核酸酶降解 2.防止化学因素降解 3.防止物理因素降解 二.DNA的分离纯化 三.RNA的分离纯化 四.核酸组分的分离纯化 破细胞（1mol/LNaCL） 离心去沉淀（含RNA-Pr） 上清（含DNA-Pr） SDS法/酚法（去蛋白） 离心去沉淀（变性蛋白） 上清（含DNA） 乙醇沉淀 离心收集沉淀（DNA） 细胞（饱和酚处理） 离心去沉淀（含DNA-Pr） 上清液调节PI（RNA PI） 离心去上清 收集沉淀（总RNA） 不同的RNA分离时可用： DEAE-Sephadex 超离心 Olig-dt 亲和层析 1.离子交换法： 四种核苷酸之间的分离采用离子交换法 阳离子交换剂洗脱次序： 理论次序 U G A C 实际次序 U G C A 阴离子交换剂洗脱次序： 理论次序 C A G U 实际次序 C A U G 2.凝胶过滤法: 碱基,核苷,核苷酸之间的分离采用Sephadex-G10/G25 洗脱次序：核苷酸 核苷 碱基 核苷一磷酸,核苷二磷酸,核苷三磷酸的分离采用柱层析和 薄层层析法分离. 柱层析洗脱次序 AMP ADP ATP 薄层层析迁移次序 AMP ADP ATP 3.DEAE-纤维素法: 五.核酸及其组分含量的测定与纯度测定 （一）.核酸含 量的测定方法 1.紫外吸收法 1ug/ml DNA A260 = 0.02 1A260 = 50 Ug/ml DNA 1ug/ml RNA A260 = 0.022-0.024 1A260 = 40 Ug/ml RNA 2.定糖法 (20-250ug RNA,40-400ug DNA) 苔黑酚法：苔黑酚+核糖+浓HCl+FeCl3 绿色 A670-680 二苯胺法：二苯胺+脱氧核糖+浓H2SO4 蓝色 A595-620 3.定磷法 (10-100ug 核酸) 4.凝胶电泳 EB( 0.5ug/ml)染色, 最小检出量1ng VitC H3PO4 +钼酸铵 黄色磷钼酸铵 磷钼蓝 A650-660 （二）. 核酸纯度的测定 1.紫外吸收法 测定A260与A280 A260 A280 =1.8-2.0DNA: 2.凝胶电泳 3.等密度梯度离心 2.0 RNA: A260 A280 凝胶电泳 等密度梯度离心 第六节核酸研究的常用技术 一.DNA的凝胶电泳 （一）琼脂糖凝胶电泳 1.琼脂糖凝胶浓度及选择 2.琼脂糖凝胶电泳的分辨率 3.琼脂糖凝胶电泳的用途(分离,测量,回收,印迹) （二）PAGE电泳 1. PAGE浓度及选择 2. PAGE电泳的分辨率 3.PAGE电泳的用途 （三）影响凝胶电泳Rf值的因素 1.分子大小 2.分子构象 3.凝胶浓度 4.电流电压 5.温度 二.印迹技术与分子杂交 （一）.印迹技术 概念:核酸的杂交中，经过凝胶电泳分离的DNA/RNA分子，杂交 之前通过毛细管吸附作用/电导作用将凝胶中DNA/RNA分子原封 不动地转移到滤膜上。 滤膜:硝酸纤维素滤膜， DEAE-纤维素滤膜 印迹种类: Southern blotting:（1975） Northern blotting:（1979，Alwi