pdtc对压力负荷过度诱导小鼠心肌肥大的防护作用及其机制研究(1)

PDTCPDTC 对压力负荷过度诱导小鼠心肌肥大对压力负荷过度诱导小鼠心肌肥大 的防护作用及其机制研究的防护作用及其机制研究(1)(1) 【摘要】目的观察吡咯烷二硫基甲酸盐（PDTC）对心肌肥 大发生发展的影响并探讨其机制。方法以缩窄小鼠主动脉 弓诱导的心肌肥大为模型，观察 PDTC 对心肌肥大发生发展 的影响，并采用 EMSA 检测心肌组织中 NF-B 结合活性， 应用 Westernblot 方法分析心肌组织中 phospho-GSK3 的 表达水平。结果缩窄小鼠主动脉弓 2 周后，心脏重量/体重 比值与假手术组相比增高%，而且肥大心肌组织中 NF-B 结合活性和 phospho-GSK3 蛋白表达明显高于假手术组。 PDTC 可明显减轻 TAC 诱导的心肌肥大，与 TAC 模型组相比 可以使小鼠心脏重量/体重比值下降%。PDTC 可抑制心肌组 织中 NF-B 活性，与 TAC 模型组相比降低了%，同时亦可 抑制心肌组织中 GSK3 磷酸化水平，p-GSK3/GSK3 比 TAC 模型组降低了%。结论 PDTC 可以通过抑制 NF-B 结合 活性和 GSK3（Ser9）磷酸化水平延缓心肌肥大的发生发 展。 【关键词】心肌肥大；吡咯烷二硫基甲酸盐；核因子 B； 糖原合成激酶-3 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheroleandmechani smofPDTConthedevelopmentofcardiachypertrophyinvivo. MethodsPVB/Nmicewereemployedandcardiachypertrophywa sinducedbytransverseaorticconstrictionfor2mobilitys hiftassaywasusedtodetermineNFkBbindingactivitywithn uclearproteinsextractedfromhearttissues；Westernblo tswereperformedtoexaminethephosphorylationofGSK- 3.Inaseparateexperiment，PDTCwasadministeredintom icesubjectedtotransverseaorticconstrictionfor2weeks.R esultsTransverseaorticconstrictionsignificantlyincr easedtheratioofHW/BW.TwoweeksafterTAC，theratioofHW /BWwassignificantlyincreasedby%，comparedtoage- matchedshamcontrol.NFkBbindingactivityandthelevelof phospho-GSK- 3weresignificantlyincreasedat2weeksfollowingTACco mparedtoage- matchedshamcontrol.AdministrationofPDTCintoTACmicef or2weeks，significantlyreducedtheratioofHW/BWby%，c omparedtonon- treatedTACmice.NFkBbindingactivitywassignificantlyr educedby%intheheartsadministeredwithPDTCfor2weeks， comparedtonon- treatedTACgroup.Inaddition，administrationofPDTCals odecreasedthelevelofphospho-GSK-3/GSK- 3by%comparedtonon- treatedTACgroup.ConclusionPDTCinhibittheNFkBbinding activityandthelevelofphospho-GSK- 3inhypertrophichearttissuesandtherebyattenuatesth edevelopmentofcardiachypertrophy. 【Keywords】 cardiachypertrophy；pyrrolidinedithiocarbamate；NF- B；GSK-3 心肌肥大是心脏对生物机械牵张和神经体液刺激的一种主 要反应。虽然早期心肌肥大是心脏维持有效心输出量的一 种代偿性机制，但持久的心肌肥大会导致心脏进入失代偿 阶段，继而发生不可逆转的心肌肥大和扩张，心肌收缩力 下降，导致心力衰竭1，2 。调控心肌细胞肥大的详细分 子机制及关键的信号转导通路迄今尚未阐明。最近的研究 提示核因子-B（nuclearfactorkappaB，NF-B）信号通 路可能在心肌肥大的发生发展中起着重要作用2，3 。吡 咯烷二硫基甲酸盐 （pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）是 NF-B 抑制剂， 通过其抗氧化作用可抑制肿瘤坏死因子 （tumornecrosisfactor，TNF）诱导的反应性氧自由基的 产生和 NF-B 活性4 。Dechend 等也报道抗氧化剂可通 过抑制 NF-B 活性而解除 Ang所诱导的心肌细胞肥大性 反应5 。然而，Hayakawa 等报道 PDTC 抑制 NF-B 活性 与抗氧化功能无关6 。为此，本研究以压力负荷增加诱 导的小鼠心肌肥大为模型，进一步探讨 PDTC 抑制 NF-B 活性的机制，并观察 PDTC 对心肌肥大发生发展的影响。 1 材料与方法 材料药品与试剂：水合氯醛、PDTC；NF-B 寡核甘酸、 T4Polynucleotidekinase、GelShiftBanding5xBuffer；Pi erceBCA 蛋白分析试剂；-32pATP；p-GSK3、anti- RabbitIgGHRP-Linked 抗体；GSK3；ECL 化学发光试剂盒； KaleidoscopePrestainedStandards 蛋白质 Marker；SDS、 丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷。实验动物：雄性 PVB/N 小鼠，美国东田纳西州大学实验动物中心提供。 方法 小鼠心肌肥大模型的建立 PVB/N 小鼠周龄达 67 周时，经 水合氯醛麻醉后，通过气管插管与啮齿动物呼吸机连接， 进行人工通气。于胸部左侧第 23 肋间打开胸腔，分离主 动脉弓并在其下穿一丝线，按统一标准使主动脉缩窄，关 闭胸腔。假手术组除了不进行 TAC 外，其余手术程序完全 与模型组相同。 实验分组及给药实验分为 3 组：假手术组：假手术组除了 不进行主动脉缩窄外，其余手术程序完全与模型组相同； TAC 模型组：缩窄主动脉弓二周；PDTC 处理组：小鼠于 TAC 前 1h 开始腹腔注射 PDTC，剂量 120mgkg-1d-1，持续 2 周。 样本的收集与检测心脏重量/体重比值：TAC2 周后，用水合 氯醛麻醉小鼠后，取出心脏，统一标准修剪心脏、称重， 计算心脏重量/体重比值，作为评估心肌肥大的指标。取左 心室，-70保存待用；胞浆、胞核蛋白的提取：左心室肌 组织中加入 BufferA 充分匀浆，在冰上放置 1530min，再 加入适量的 10%NP-40，混匀 1min，4、10000r/min 离心 3min，上清即为胞浆蛋白。沉淀用 BufferC 悬浮混匀，冰 上放置 12h，不时振动，再在 4、14，000 转/min 离心 10min，上清即为核提取物。采用 Bradford 方法，以 BSA 作标准测定胞浆和胞核蛋白浓度。胞浆和胞核蛋白提取物 于-80保存备用；NF-B 活性的检测：采用凝胶迁移率实 验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）方法。 本实验中 NF-B 同序寡核苷酸探针如下：3- TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5；5- AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3，采用 T4 寡核苷酸激酶法以 -32P-ATP（3000Ci/mmol）标记探针。核蛋白-DNA 探针结 合反应体系为：等量核蛋白提取物（30g） ， 35fmols-32p标记的双链 NF-B 寡核苷酸，反应总 体积为 15l。室温静置 20min 后加入加样缓冲液，经 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。干胶后，-80放射自显 影，图像采用 Bio-Rad 公司的 phosphor-图像分析系统进行 定量分析。Westernblot 分析：经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE）分离待测蛋白，并将其转移至硝纤膜上， 用封闭缓冲液封闭 1h，然后与相应的特异