基因突变的检测ppt课件

基因突变变的检测检测 一、突变类型 营营养缺陷型：野生型菌株经过经过 人工诱变诱变 或者自然突变变失 去合成某种营营养（氨基酸，维维生素，核酸等）的能力，只 有在基本培养基中补补充所缺乏的营营养因子才能生长长，成 为营为营 养缺陷型。营营养缺陷型是一种生化突变变株，它的出 现现是由基因突变变引起的。 抗性突变变型：野生型菌株因发发生基因突变变，而产产生的对对 某化学药药物、致死物理因子或噬菌体的抗性变变异类类型。 他们们可在加有相应药应药 物、用相应应物理因子处处理或含有噬 菌体的培养基平板上选选出。例如对对一些抗生素具有抗药药 性的菌株等。 细菌真菌和病毒基因突变的检测 条件致死突变变型：某菌株或病毒经经基因突变变后，在某种 条件下可正常的生长长繁殖并呈现现其固有的类类型，而在另 一种条件下却无法生长长、繁殖，这这种突变类变类 型称为为条件 致死突变变型。 形态态突变变型：由突变变引起的个体或菌落形态态的变变异，如 细细菌鞭毛或荚荚膜的有无，霉菌或放线线菌的孢孢子有无或颜颜 色变变化，细细菌产产可溶性色素的变变化、菌落表面的光滑、 粗糙以及噬菌体的大小或清晰度等的变变化。 抗原突变变型：由于基因突变变引起的细细胞抗原结结构发发生的 变变异类类型。 产产量突变变型：通过过基因突变变而产产生的在代谢产谢产 物产产量上 明显显有别别于原始菌株的突变变体，称产产量突变变型。 营养缺陷型菌株法（Ames试验） 鼠伤伤寒沙门门氏菌的组组氨酸营营养缺陷型（his）菌株，包 括碱基置换换突变变型和移码码突变变型，在含微量组组氨酸的培 养基中，除极少数自发发回复突变变的细细胞外，一般只能分 裂几次，形成在显显微镜镜下才能见见到的微菌落。受诱变剂诱变剂 作后，大量细细胞发发生回复突变变，自行合成组组氨酸，发发育 成肉眼可见见的菌落。某些化学物质质需经经代谢谢活化才有致 变变作用，在测试测试 系统统中加入哺乳动动物微粒体酶，其中的 酶能使一些前诱变剂转变为诱变剂诱变剂转变为诱变剂，可弥补补体外试验试验 缺乏代谢谢活化系统统之不足。 淘汰野生型法 抗生素法 青霉素可抑制细细菌细细胞壁的合成，是新分裂的细细菌细细胞不 能合成新的细细胞壁，这样这样 分裂的细细菌细细胞就处处于部分原 生体状态态。在培养基的低渗条件下就可能破裂死亡。经经 诱变处诱变处 理的细细菌在添加青霉素的基本培养基上培养几个 周期，其大量生长长的野生型细细菌会因细细胞分裂，新的细细 胞壁合成被青霉素抑制而处处于原生体状态态，低渗破裂而死 亡，而营营养缺陷型因其生长营长营 养物质质自身不能合成，又 不能在基本培养基中获获得，因而并不发发生分裂，青霉素也 不能对对其发挥发挥 作用。这样发这样发 而存活下来，经经几个细细胞周 期后，收集菌体，再经经完全培养及培养，负选择负选择 法筛选筛选 就可获获得营营养缺陷型突变变。酵母菌用制霉素法：制霉素 作用于真菌细细胞膜上的甾醇，引起细细胞膜的损伤损伤 ，杀杀死 生长长繁殖过过程的真菌，起到富集营营养缺陷型的作用。 菌丝过滤丝过滤 法 真菌和放线线菌等丝丝状菌的野生型孢孢子在基本培养基中能萌 发长发长 成菌丝丝，而营营养缺陷型的孢孢子则则不能萌发发。把诱变诱变 处处理后的孢孢子移入到基本培养液中，振荡荡培养10h左右， 使野生型孢孢子萌发发的菌丝刚刚丝刚刚 肉眼可见见，用灭灭菌的脱脂 棉、滤纸滤纸 或玻璃漏斗除去菌丝丝。继续继续 培养，每隔34h过过 滤滤一次，重复3-4次，最大限度地除去野生型细细胞。然后 稀释释、涂皿分离。 高温杀杀菌法 利用芽孢孢杆菌类类的芽孢孢和营营养体对热对热 敏感性的差异，让让 诱变诱变 后的细细菌形成芽孢孢，然后把处处在芽孢阶孢阶 段的细细菌移 到基本培养液中，振荡荡培养一定时间时间 ，野生型芽孢孢萌发发 ，而营营养缺陷型芽孢孢不能萌发发。此时时将培养物加热热到 80，维维持一定时间时间 ，野生型细细胞大部分被杀杀死，缺陷 型则则得以保留，起到了浓缩浓缩 作用。 夹层夹层 培养法 先在培养皿上倒一薄层层基本培养基，凝固后再倒一层经过层经过 诱变处诱变处 理的菌液，其上再浇浇一层层基本培养基；经经培养后 ，对对首次出现现的菌落用记记号笔在皿底标记标记 ，然后再倒一 层层完全培养基，再培养，出现现的形态较态较 小的新菌落，多 为为缺陷型。 噬菌斑法 利用宿主范围围、生长长速度、噬菌斑大小、形态态等性状可 对对病毒进进行突变变的检测检测 。大肠肠杆菌T4噬菌体快速溶菌 突变变体就可导导致受体细细胞快速裂解，形成大而透明的噬 菌斑，根据在不同大肠肠杆菌品系中的表现现，又可细细分为为 、三种不同的突变变体。有些病毒基因发发生突 变变后不但可以改变变其宿主范围围、繁殖速度、毒性也可能 发发生改变变。 局限性转导 温和噬菌体感染受体菌后，其染色体会整合到细细菌染色体 的特定位点上，从而使宿主细细胞发发生溶源化，例如噬菌 体，其插入位点的二侧侧分别别是gal和bio基因；如果该该溶源 菌因诱导诱导 而发发生裂解时时，在前噬菌体二侧侧的少数宿主基 因，（对对噬菌体分别别是gal和bio基因），会因偶尔发发生 的不正常切割而连连在噬菌体DNA上，由此产产生了一类类特 殊的噬菌体-缺陷噬菌体，缺陷噬菌体除含大部分自身 的DNA外，缺失的基因被几个位于前噬菌体整合位点附近 的宿主基因取代，这样这样 形成的杂杂合DNA分子在宿主细细胞 内能够够象正常的噬菌体DNA分子一样进样进 行复制、包装， 提供所需要的裂解功能，形成转导颗转导颗 粒。但该该缺陷噬菌 体没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细细胞后 ，通过过DNA整合进进宿主染色体而形成稳稳定的转导转导 子。 果蝇蝇突变变体的检测检测 CIB法 果蝇蝇有一个品系称l系,可以检测检测 到X染色体上的任何致 死突变变或其他非致死突变变，染色体上有一个大的倒位 ；隐隐性致死突变变；显显性棒眼基因。由于基因而使 雄果蝇蝇不能存活，基因可作为标记为标记 ，凡带带有lX染 色体的雌果蝇蝇可以从棒眼性状上加以辩认辩认 ，大的倒位 可以抑制lX染色体与另一同源染色体交换换。检测检测 的方 法是让让受检检的雄果蝇蝇与l雌果蝇杂蝇杂 交，所生子代应为应为 ：。在雌蝇蝇中有半数带带l，可以从棒眼上加以 辩认辩认 ，在这这些棒眼雌蝇蝇中的两条染色体，一条是l ，另一条是受检检雄蝇蝇来的染色。将这这一棒眼雌性与正 常雄性单对单对 交配，观观察子二代的性状。 Muller-5法 Muller-5品系，是人工创创造的一个果蝇蝇品系。它的X染色 体上带带一个棒眼基因B，一个杏色眼w和一个倒位区段。 倒位区段的存在可以抑制杂杂合体的交换换重组组。用经诱变经诱变 处处理的雄蝇蝇，与Muller-5品系雌蝇杂蝇杂 交，得到子一代后再 做单对单对 交配，看F2代的分离情况。如有致死突变变，子二 代中没有野生型雄蝇蝇，如有隐隐性的形态态突变变，则则除 Muller-5雄蝇蝇外，还还可出现现具有突变变性状的雄蝇蝇。（如 图图所示） 这这个技术术的缺点：1只能检检出完全致死的隐隐性基因。2 有时时Y染色体上有些正常作用的基因可能降低X染色体 上的致死效应应，给结给结 果带带来误误差。 这这个技术术的优优点：1子二代中有野生型还还是没有野生型 可以客观观地决定。2致死基因存在于子二代杂杂合体蝇蝇 中，供进进一步研究使用，而不会马马上丢丢失。3可研究致 死基因（e）在杂杂合体中的作用。4同样样的方法可以检检 测隐测隐 性可见见突变变。 并连连X染色体法可以检测检测 出X染色体上的隐隐性非致死突变变 ，该该法用一种特殊的雌果蝇为蝇为 一有两条紧紧密相连连并不分 离X染色体称为为并连连X染色体及Y染色体构成的XXY果蝇蝇 。该该果蝇蝇可正常生活并产产生两种（XX或Y），再经诱变经诱变 处处理的雄果蝇蝇交配后，所得的雌果蝇为蝇为 XXY，可正常生 活，3X超雌不能成活，另一半雄果蝇蝇的表现现就与诱变诱变 的 效果直接相关，可能表型正常，突变变及死亡。 常染色体突变变的检检出 平衡致死法可检检出常染色体上的突 变变基因。例如果蝇蝇在第二染色体上有一个Cy基因（Curly ，卷翅），这这个基因对对正常翅是显显性的，但在致死作用 上却是隐隐性的。同时时在这这条染色体上还还有一个大的倒位 ，Cy在倒位段内，以抑制重组组的发发生。在其同源染色体 的另一成员员上有一个显显性突变变基因S（star，星状眼）， 也是纯纯合致死的。所以这这个品系是一个平衡致死品系。品 系内个体间间相互交配之后，只出现现一种与亲亲代完全一样样 的后代Cy+/+S，其表型是卷翅、星状眼。 利用这样这样 的永久杂杂种检测检测 第二染色体上的突变变基因时时， 先将该该品系的雌蝇蝇和待测测的雄蝇杂蝇杂 交，在F1挑选选卷翅雄 体再与该该品系的雌体作单对单对 交配，分别饲别饲 养。在F2选选取 卷翅的雌雄个体相互交配，到F3可出现现以下情况（图图16- 14） （1）如被检测检测 的第二染色体不带带有致死突变变， 则则有1/3左右的野生型出现现。（2）如被检测检测 的第二染色 体带带有致死突变变，则则全部是卷翅果蝇蝇。（3）如发发生可见见 的隐隐性突变变，还还有1/3左右的突变变型。 人类类突变变的检测检测 系谱谱分析：对对于常染色体显显性遗传遗传 ，特别别是显显性完全时时 ，其突变变比较较容易检测检测 ；而对对常染色体隐隐性遗传遗传 的基因 突变变，由于不能判断隐隐性性状是由于两个杂杂合体婚配， 还还是隐隐形突变变的结结果，因而难难以检检出。 如果某一显显性突变变先证证者，其父母均为为正常，二期显显性性 状可规则规则 的遗传给遗传给 其后代，则则可推断该该先证证者的父母一 方在形成配子时时可能发发生了显显性突变变。如果遗传遗传 不规则规则 ，其父母有一方可能是该该基因的携带带者但不表现现，因而 并比一定是基因突变变的结结果 由于人的性别别决定为为XY型，X染色体上许许多基因在Y染色 体上并无等位的基因，因而不论论是显显性还还是隐隐形在男性 中X染色体上的基因大多数均可表达。如果有一男性先证证 者，表现现某X-连锁隐连锁隐 形突变变性状，则则其母亲亲提供的X染 色体有一定突变变基因。如果母亲亲表型正常则则可能是杂杂合 体或是产产生的卵子发发生了突变变，如果该该母亲亲所生其他子 女均无该该突 变变性状，则则可以肯定先证证者所接受的其母亲亲的X染色体是X 连锁隐连锁隐 性突变变的结结果，如果该该母亲亲所生子女有一半具有 该该突变变性状，则则肯定是携带带者而并非突变变之故。由于一 个家庭人数较较少，这这种分析仍有很大的局限性和误误差。 PCR技术术在突变变基因检测检测 中的应应用 从广义义的角度来看，基因突变变包括点突变变，染色体突变变 和基因组组突变变三种形式，只是它仍所涉及的范围围不同， 后两种基因突变变涉及的基因较较多，可通过过光学显显微镜镜分 析细细胞有丝丝分裂中期的染色体而检检出.亦可在间间期用标记标记 探针检针检 出，点突变变通常的涉及的范围较围较 少，它是肿肿癌和 遗传遗传 病发发生的主要分子改变变，因此，它是基因分析的主 要研究内容.不同类类型的基因突变变有不同的检测检测 途径，大 致方法包括：应应用基因探针针直接检测检测 ；应应用PCR 技术检术检 测测；利用探针针技术进术进 行分析。 （一）点突变变的PCR直接检检出 当基因内缺失时时，可用已知的该该基因DNA序列在缺失片 段的两侧设计侧设计 一对对引物，然后进进行PCR，对对其产产物行琼琼 糖凝胶电电泳，EB染色，紫外检测仪检测仪 下检测检测 有无特异性的 扩扩增产产物，即可非常容易的判断待检检称本中有无DNA片 段的缺失. 一对对引物PCR检测检测 缺失如果一个基因的DNA序列已经经清 楚，其缺失部位亦较为较为 固定，即可根据缺失发发生区域的 DNA序列在缺失片段的两侧侧合成一对对合适的引物进进行 PCR，然后琼琼脂糖凝胶电电泳及EB染色，短波紫外灯下观观 察有无特异性的扩扩增片段，该该方法是检测检测 基因片段缺失 最为为快速的方法，在实际应实际应 用中，为为了避免因某些原因 引起的扩扩增失败败而导导致假阴性结结果的出现现，常在反应应体 系中加入一对对与缺失片段无关的基因引物，同时时加以扩扩 增，以确定无特异性扩扩增带带并非因反应应体系的原因的引 起.如在应应用PCR技术进术进 行X地贫贫Bart基因胎儿水肿综肿综 合征义义基因缺失检测时检测时 ，常用一对对引物扩扩增缺失区域， 同时时同一对对基因引物扩扩增基因的一个片段，然后电电泳 检测检测 .若同时时即有和基因的特异性扩扩增产产物，若无基 因的扩扩增产产物则说则说 明模板DNA中有 基因的缺失，为为 Bart胎儿水肿综肿综 合征. 多对对引物的多重PCR检测检测 缺失：对对于某些遗传遗传 病的致病 基因来说说，其缺失具有明显显的异质质性，即在不同患者其 缺 失片段有所不同，因而难难以用一对对缺失部位的引物将 所有的缺失检检出，在这这种情况下，我们们可设计设计 多对对引物 检测该检测该 基因的不同外显显子区域，即用同一PCR体系扩扩增 多个外显显子然后用琼琼糖凝胶电电泳检测检测 有无缺失的片段， 若某一特异性的扩扩增产产物带带缺如， 则则可判定为该为该 片段的 缺失，该检测该检测 方法是对对已知结结构基因有无缺失片段的最 快速可行的检测检测 途径，目前已用于多种遗传遗传 病基因缺失 的检测检测 .如在DMD/BMD缺失型突变变的检测检测 中，用23对对引 物分为为三组进组进 行多重PCR可改98%的缺失得以检检出，另 外还还有人用9对对物进进行两组组多重PCR，大约约可检检出 DMD/BMD92%的缺失型突变变. 用PCR技术进术进 行杂杂合性丢丢失的检测检测 ：有报报道，PCR技术术 尚可用于检测杂检测杂 合性丢丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量 技术进术进 行检测检测 . 单链单链 构象异构多态态分析技术术（SSCP） RNA 单链钩单链钩 象多态态性检测检测 （PCR-rSSCP） 双脱氧测测序单链单链 片段构象多态态性分析（PCR-ddF） 限制性内切酶指纹纹技术术（PCR-REF） 该该方法的原理是基于序列不同的DNA单链单链 片段，其空间间 构象亦有所不同，当其在非变变性聚丙烯酰烯酰 胺凝胶中进进行 电电泳时时其泳的位置亦发发生变变化而表现现出不同序列单链单链 其 电电泳迁频频率的差异，从而据引判断有无突变变存在.对对于一 段DNA来说说，其单链单链 具有特定的空间间构象，这这种空间间构 象的形成与该该段DNA的碱基序列有关，当这这段DNA发发生 突变变，基碱基序列亦发发生相应应的变变化，空间间相象亦随之 改变变，研究发现发现 ，不同空间间构象的DNA单链单链 在中性聚丙 烯酰烯酰 胺凝胶电电泳时时的迁效率有所不同，这样对这样对 于同一段 单链单链 DNA来说说，这这种空间间构象的变变化及电电泳迁移的改变变 即能说说明其有突变变的发发生因此，可用经经PCR扩扩增的DNA 片段经变经变 性成单链单链 然后在中性胶中电电泳，即可检检出有无 突变变. 限制性片段长长度多态态性（RFLP） 直接检测检测 限制性内切酶切点的变变化PCR产产物酶解分析 PCR产产物的酶解分析，主要用于检测检测 可引起酶切位 点改变变-包括所增加的酶切位点及原有的酶切点消失的单单 碱基置换换性点突变变.当某一点突变变引起DNA片段中酶切位 点发发生改变时变时 ，则则可用酶切位点两侧侧的引物扩扩增一含该该 切点的DNA片段，然后用相应应的内切酶进进行处处理，电电泳 检测检测 ，与正常的无改变变的片段进进行对对比分析即可确定有 无酶切位点的改变变.比如镰镰状细细胞贫贫血的发发生即是由一酶 切位点的改变变，正常情况下靶DNA的扩扩增产产物为为294bp ，经经OxaNI消化后产产生191bp和103bp二个片段，但镰镰状 细细胞贫贫血的突变变使该该切点消失，OxaNI消化后仍为为 294bp的片段，而杂杂合子则则是有294、191和103 三个片 段。用引方法检测检测 突变变快速可简简便，但必须须在突变变点涉 及到限制性内切酶切关，因此其应应用受到限制，反能检检出 点突变变的极少一部分。 3特异PCR，扩扩增阻滞突变变系统统及等位特异PCR. 在PCR扩扩增时时，引物的延伸是从其3未端开始的，而 这这种延伸的进进行要求引物3端的碱基与模板需完全配对对， 只有这样这样 引物才能延伸，扩扩增才得以进进行下去而得到预预 期 的扩扩增产产物，若引物3端与模板不能配对对，则则引物的 延伸即阻断，不能得到相对应对应 的扩扩增产产物，基于以上事 实实，可利用3端含突变变碱基的引物来检测检测 靶DNA中有无 相应应的突变变位点，此即3特异PCR，扩扩增阻滞突变变系统统 及等位特异PCR.该该反应应系统统包含两个PCR扩扩增反应应，有 两对对引物但它们们的3端有差异，一为为正常引物，另一为为3 端突变变的引物，正常引物只与正常模板互解，PCR时扩时扩 增相应应的产产物，而突变变的引物只与突变变的模板附扩扩增出 相应应的产产物.扩扩增完成后可直接同琼琼脂糖电电泳技术检测术检测 分 析结结果。利用该该系统进统进 行基因突变检测时变检测时 不仅仅能检检出突 变变的纯纯合子，而且能检检出杂杂合子个体，在这这种情况下， 同一个体的DNA模板利用突变变引物和正常引物均能引发发 扩扩增反应应. 尚可利用多对对突变变引物和正常引物进进行多重3- 特异PCR，可攻DNA分子上的多位点变变化的鉴鉴定准确快 速，简简便。 PCR直接测测序 DNA序列分析是检测检测 基因突变变最直接最可信的方法， 它不仅仅可确定突变变的部队队，而且还还可确定突变变的性质质 .PCR直接测测序是指对对PCR产产物进进行的直接序列分析，而 不是家传传的测测序技术术先将DNA待测测片段克隆于测测序载载体 上，这这不仅仅大大的简简化了操用步骤骤，节节省大量的人力和 物力，而且可实现实现 自动动化操用，加之新的荧荧光检测检测 技术术 的应应用，使测测序的效率大大提高. 采用PCR循环环直接测测序时时，应应首先将扩扩增产产物转转化 为单链测为单链测 序模板，目前常用的转转化方法为为不对对称PCR， 即在反应应体系中引物浓浓度的差异来形成单链单链 DNA，通常 侧侧引物 的浓浓度为为1001.当某一引物被耗尽后，另一引物 扩扩增的片段即为单链为单链 然后即可用于测测序，此外，获获得单单 链链DNA还还有磁珠俘获获法，外切酶消化法，PCR直接测测序 的最新发发展是将双脱氧络络子技术术与PCR技术术相结结合进进行 循环测环测 序，在PCR反应应体系中同时时将ddNTP加入，并利 用同位素或荧荧光素标记标记 的引物引导扩导扩 增后，得模板的扩扩 增与测测序同时进时进 行，其特异在于使用的模板量小且不需 分离单链单链 . PCR-寡核苷酸探针针斑点杂杂交(PCR-ASb) 如果一个基因的突变变部位，性质经测质经测 序分析已经阐经阐 明，即可用该该方法直接检测检测 突变变.该该方法的原理即利用人 工合成的寡核苷酸片段作为为探针针，与经经PCR扩扩增获获得的 靶DNA进进行杂杂交，在严严格控制杂杂交条件的前提下，通过过 斑点杂杂交式其它类类型的杂杂交来检测检测 PCR产产物中有无对应对应 突变变，即探针针与靶DNA片段之间间只要有一个碱基不相互 配对对或错记错记 ，就能检检出. (1)探针针一般合成两个，一个为为正常序列，另一含有 突变变位点，前者与正常靶DNA完全互补补，后者只与突变变 DNA互补补，该该探针针称之为为等位特异寡核苷酸探针针(ASO探 针针). (2)杂杂交类类型，传统传统 的PCR-ASO技术术主要是将PCR ，占物固定于杂杂交膜上，然用不同的标记标记 探针检测针检测 ，亦 有将已标记标记 好的探针预针预 先固定于杂杂交膜上，再使之与 PCR产产物结结合，检测检测 有无完全互补补的DNA产产物. (3)探针针的标记标记 ，最先应应用的标记标记 物为为放射性物质质有 32P，34S，半衰期及放射性危害不能普遍应应用.PCR技术术 的引进进使可在短时间时间 内获获得足够够量的靶 DNA片段，因而 对对探针针的要求亦有的降低，因非同位素标记标记 的探针针亦可 获获非常满满意的结结果，它不仅仅使ASO探针针使用起来更简简便 ，而且无同位素半衰期的限制，操作亦更安全，适合于临临 床应应用.目前已用PKU，地贫杂贫杂 的基因突变检测变检测 . 异质质性双链链构像多态态性分析（HTX） 在同一扩扩增体系中，若同时时含有正常模板和突变变型 模板时时，随着PCR的循环进环进 行，野生型基因片段和突变变 型片段均可扩扩增，并形成了异源双链链，由于异源双链链中 未配对对区的出现现，因而其空间间构型亦发发生改变变，这这机型 上的差别别即形成电电泳图谱图谱 上的差异，这这种方法适合于较较 小DNA片段的分析，一般在300bp以下，其敏感性与 SSCP相似，该该技 术简术简 便，适用于快速的突变检变检 出，已 用于多种遗传遗传 病基因突变变的研究. 随机扩扩增多态态性DNA 随机扩扩增多态态性DNA(RAPD)将通常PCR反应应中使用 的两个特定序列的引物改为单为单 一的由10个碱基构成的随 机引物，并运用大量的不同序列的随机引物进进行扩扩增，使 基因组组DNA多态态性充分展现现出来。由于RAPD技术术允许许 在事先未知DNA序列的情况下检测检测 基因组组中存在的多态态 性，大大方便和拓宽宽了对对基因组组DNA变变异的研究，而使 这这一技术术一出现现就首先被用于分子系统统学研究中。另外 ，由于RAPD技术术可以在一次反应应中检测检测 基因组组的多个 位点，能快速寻寻找两组组或多组组DNA样样品间间的多态态性。 变变性梯度凝胶电电泳(DGGE) DGGE是检测检测 基因突变变故为为精确的方法，它不仅仅可 检测单检测单 一片段的单单点突变变，对对多点突变变的检测检测 亦较较容易 ，该该方法与PCR技术术相结结合，使其能非常快速的对对大量 标标本进进行分析. 对对于一DNA片段来说说，其Tm值值与基碱基 组组或有关，当其碱基组组成发发生变变化时时，Tm 值值亦改变变， 因此，对对于突变变的片段来说说，若其在一变变性物质线质线 性梯 度增加的凝胶上进进行电电泳时时，随着变变性剂浓剂浓 度的增加， 当这这种浓浓度达一定值时值时 突变变的DNA片段发发生解链链而形成 分叉，其电电泳迁移速度变变慢.因此突变变的DNA片段与正常 的DNA片段电电泳的迁移位置有差别别，研究证证明DGGE可 检检出任何类类型的单单碱基取代，如果将突变变型与正常的 DNA片段形成异源双链时链时 ，其敏感性大大提高. 恒定变变性胶电电泳(CDGE) CDGE是DGGE基础础上发发展起来的基因突变检测变检测 技 术术，亦是利用突变变基因与正常基因片段间间Tm值值的差异来 检测检测 突变变的方法，该该方法与DGGE的区别别在于聚丙烯酰烯酰 胺中的含的变变 性剂浓剂浓 度相当于含突变变基因片段的Tm值值，而且浓浓度恒定 ，而不是线线性递递增.为为了提高DGGE和CDGE的检测检测 敏感 性，通常在一侧侧引物的5端设计设计 一含GC的区域，避免了 DNA的完全解链链，从而提高了突变变的检检出率，可达 100%. 温度梯度凝胶电电泳(TGGE) 该该方法是将PCR扩扩增的产产物量一中性聚丙烯酰烯酰 胺凝 胶上，在一温度线线性梯度上升的电场电场 中进进行电电泳，当 DNA双链链到达其Tm时时，双链链解开，形成分叉，而影响电电 泳迁移 率，突变变的扩扩增产产物其Tm值值与野生型有明显显不 同，因而有不同的解链链区，从而造成电电泳迁移效率的差 别别，据此可判断检检材中DNA有无突变变. 除上述的几种以PCR为为基础础的突变检变检 出技术术外，还还有错错 配碱基化学裂解法，PCR产产物的RNA酶检检出法及引物竞竞 争法用于基因突变变的检检出，化学裂解法以期敏感性高， 检测检测 片段长长而应应用更为为广泛. 总总之，以PCR技术为术为 基础础建立的基因突变检测变检测 技术术 有多种，而且各有其优优缺点，但目前较为较为 广泛应应用的为为 PCR-SSCP，PCR-ASO及PCR循环环直接测测序。 从基因表达产产物入手，进进行间间接检测检测 基因突变变的方法， 如蛋白质质截断实验实验 （PTT），体外合成蛋白质测质测 定（ LVSP近来发发展应应用于与人类类疫病有潜在联联系的基因突变变 的检测检测 运用这这一试验试验 。几种基因突变变，包括剪切点变变 换换、框外缺失、插入突变变和大于 25hp的框内缺失以及无 义夹变义夹变 都可在大片段cDNA中快速而敏感地分析出来，使 用了一个包括RNA聚台酶启动动子和真核生物翻译译起始信 号在内的上游PCR引物，这这一经经修饰饰的引物允许许 PCR产产 物进进行转录转录 和翻译译合成的多肽肽通过过 SDS 聚丙烯酰烯酰 氨凝 胶电电泳进进行分析。蛋白质质在大小上与野生型相异直接反 映了一个突变变影响重要蛋白质质的长长度。S 标记标记 的蛋氨酸 或其它放射性氮基酸的结结合已被用于通过电过电 泳探测测翻译译 产产物。 植物及其他动动物突变变体的检测检测 植物突变变体的检测检测 表型鉴鉴定 表型鉴鉴定是以诱变诱变 育种和基因功能研究为为目的的突变变体 筛选筛选 最常用的方法。要求必须须有能遗传遗传 的 、相对对于野生 型有显显著差异的外观观性状 ，一般也包括逆境筛选筛选 和化验验 分析筛选筛选 。表型鉴鉴定的方法虽虽然简单简单 易行 ，不需要特殊 的硬件设备设备 ，但是在突变变体鉴别鉴别 方面的作用是很有限的 。 细细胞学鉴鉴定 这这个层层次的鉴鉴定一般以研究诱变诱变 的机理及诱变诱变 因素的靶 标为标为 目的，主要通过观过观 察细细胞及细细胞器形态态的变变化 、染 色 体异常的变变化 ，研究诱变诱变 的作用机理和效果。张张月学 等 对卫对卫 星搭载载的2种苦荚荚菜种子 SP 代根尖细细胞染色体