survivin反义核酸诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究(1)

SurvivinSurvivin 反义核酸诱导乳腺癌细胞凋亡反义核酸诱导乳腺癌细胞凋亡 的实验研究的实验研究(1)(1) 作者：段体德 1，刘德权 2，杨策尧 1 【摘要】目的探讨 Survivin 反义核酸技术诱导乳腺癌 细胞凋亡的作用及效果。方法本实验共分 6 组，分为以脂 质体介导反义寡核苷酸组（ASODN/Lip） 、无义寡核苷酸组 （NODN/Lip）及 RPMI1640 培养液的空白对照组（Lip） ，转 染人乳腺癌 MCF-7 细胞系，应用 Hoechst33258/PI 双重染 色观察 MCF-7 细胞的形态学改变，透射电镜观察细胞超微 结构，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化，DNA 凝 胶电泳观察凋亡情况，研究 Survivin 反义寡核苷酸对 MCF- 7 乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果 Hoechst33258/PI 染色 及透射电镜观察可见转染后的细胞结构呈凋亡样改变；流 式细胞仪检测见转染后细胞凋亡显著增加，并出现 G2/M 期 阻滞现象；DNA 凝胶电泳在 600ng/ml，800ng/mlASODN/Lip 组的电泳图谱上呈现出明显的“梯状”现象。结论凋亡抑 制基因 Survivin 表达下调对乳腺癌细胞的生长抑制作用主 要是通过诱导细胞发生凋亡以及阻止有丝分裂发生在 G2/M 阻滞期来实现，Survivin 靶向反义核酸技术可能成为乳腺 癌基因治疗的一种有效方法。 【关键词】乳腺癌；Survivin 基因；反义核酸技术；凋亡 【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectofcellsapopt osisonhumanbreastcanceraftersurvivinwasblockedwitht heantisensetechnique.MethodsTheexperimentsweredivid edintosixgroups.AntisenseOligonucleotide，nonsenseo ligonucleotidewastransfectedinhumanbreastcancerMCF- 7celllineandRPMI1640culturemedium.ThestudyusedHoech st33258/PI，electronmicroscope，flowcytometeranding elelectrophoresisofDNAtoobservethecellsapoptosis.Re sultsThecellsapoptosisaftertransfectionwereobserved byHoechst33258/PI，electronmicroscopeandingelelectr ophoresisofresultofflowcytometershowedthecellsapopt osisaftertransfectionandtheblockingphenomenaappeare dinG2/Mperiod.ConclusionTherestrictionbythereductio nofsurvivinexpressioninbreastcancercellsismainlyfun ctionedthroughitsinductionofcellsapoptosisandpreven tionofmitosisatG2/Mperiod.Survivintargetingtherapyc anbeusedasanimportantmethodinbreastcancertreatment. 【Keywords】 breastcancer；survivingene；antisensetechnique；apo ptosis 现代分子生物学研究发现与细胞恶性增殖和分化受阻一样， 细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上亦占有重要地 位。诱导肿瘤细胞发生凋亡目前正逐步成为治疗恶性肿瘤 的一种重要的治疗方法，具有较高的选择性与靶向性。 Survivin 是近年来发现的一个新的细胞凋亡抑制基因，能 够抑制肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞得以生存，在肿瘤细胞 内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因是肿瘤基因治疗 的主要方法。在本实验研究中我们应用荧光染色、电镜、 DNA 琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等技术，从细胞形态学到 细胞周期、DNA 变化，从定性到定量进行了研究。探讨是否 可通过转染 Survivin 反义寡核苷酸（ASODN）诱导乳腺癌 MCF-7 细胞发生凋亡，为乳腺癌的基因治疗提供理论实验依 据。 1 材料与方法 细胞培养 MCF-7 人乳腺癌细胞株由中国科学院上海细胞研 究所提供。将加入含 10%小牛血清的 RPMI1640 培养液制成 的细胞悬液，镜下计数，调节细胞至约 1106 个/ml，分 别接种于 30ml 培养瓶、96 孔培养板及铺有盖玻片的 6 孔培 养板，37，5%CO2 常规培养至 80%汇片后进行转染。 脂质体介导 SurvivinASODN 转染 MCF-7 细胞 寡核苷酸的设计及合成采用 SurvivinmRNA231-251 设计互 补 ASODN，反义寡核苷酸（ASODN）序列 5CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3；对照无义寡核苷酸 （NODN）序列 5CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3，对照序列经 GeneBank 比对无相关基因，两条序列每端 5 个磷酸基采用 硫代磷酸型，即在合成时用硫基取代寡核苷酸片段磷酸上 的羟基，部分反义寡核苷酸 5FAM 荧光素标记，由上海生物 工程公司提供。 转染混合物的制备及配制 A 液：Survivin 反义寡核苷酸及 对照序列的浓度设定为： 200，400，800，1200，1600（ng/ml） ，用不含血清及抗生 素的 RPMI1640 将反义寡核苷酸配成上述浓度溶液。B 液： 将 Lipofectin：RPMI1640（不含血清及抗生素） =4l100l 的比例配成 B 液。将等体积的 A 液与 B 液混 合，室温下放置 40min 左右，使脂质体与寡核苷酸充分包 裹。寡核苷酸的终浓度为 100，200，400，600，800（ng/ml） 。 转染将不同浓度的 ASODN-RPMI1640 转染混合物加入培养瓶 或培养板中。本实验设 6 组分别为：（1）Lip 组以 RPMI1640 培养液代替转染混合物作为空白对照（加入 Lip） ； （2）无义对照（NODN）组，以 NODN/Lip-RPMI1640 转染细 胞作为无义对照；（3）200ng/mlASODN 转染组；（4） 400ng/mlASODN 转染组；（5）600ng/mlASODN 转染组； （6）800ng/mlASODN 转染组，37，5%CO2 常规培养 24h， 弃去转染混合物，胰酶消化收集细胞。96 孔板中的细胞用 于检测细胞贴壁率、细胞生长抑制率以及绘制细胞生长曲 线。 透射电镜观察 MCF-7 细胞超微结构转染接种于 30ml 培养瓶 的细胞 48h，以%胰蛋白酶/消化，戊二醛原位固定，琼脂包 埋沉淀细胞，梯度丙酮系列脱水，Epon812 系列包埋固定， 超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，电镜下观察、拍照。 Hoechst33258 与 PI 染色细胞形态学观察荧光显微镜下观察 细胞核形态及颜色改变以区分出天然细胞、凋亡细胞以及 坏死细胞。 流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期细胞转染结束后培 养 48h，每组收集 2106