人胚胎生殖干细胞对卵巢癌细胞体内外生长抑制的研究

人胚胎生殖干细胞对卵巢癌细人胚胎生殖干细胞对卵巢癌细 胞体内外生长抑制的研究胞体内外生长抑制的研究 山东大学齐鲁医院山东大学齐鲁医院 宋欣燕宋欣燕 孔北华孔北华 研究背景研究背景 人类胚胎干细胞具有正常的核型及自我更新能力，在发育人类胚胎干细胞具有正常的核型及自我更新能力，在发育 过程中能分化成多种正常表型的细胞，其生长分化受到多过程中能分化成多种正常表型的细胞，其生长分化受到多 种细胞因子及分子信号通路的调节，如种细胞因子及分子信号通路的调节，如PI3KPI3K、BMPBMP、TGFTGF 等等； 肿瘤细胞与干细胞有较多相似性，包括某些与自我更新等肿瘤细胞与干细胞有较多相似性，包括某些与自我更新等 有关的分子信号通路；这些信号通路的改变与肿瘤的发生有关的分子信号通路；这些信号通路的改变与肿瘤的发生 、侵袭有关；、侵袭有关； 肿瘤的发展也与周围微环境有关，二者相互作用影响肿瘤肿瘤的发展也与周围微环境有关，二者相互作用影响肿瘤 的生长、侵袭；的生长、侵袭； 因而，我们设想这种能支持正常发育过程的全能干细胞及因而，我们设想这种能支持正常发育过程的全能干细胞及 其微环境能否逆转异常的肿瘤细胞表型。其微环境能否逆转异常的肿瘤细胞表型。 加拿大麦克马斯特癌症与干细胞研究所加拿大麦克马斯特癌症与干细胞研究所(McMaster Cancer (McMaster Cancer and Stem Cell Research Institute)and Stem Cell Research Institute)的研究人员报告说，胚胎的研究人员报告说，胚胎 干细胞可以制造特别的壁龛细胞，然后这些壁龛细胞会释干细胞可以制造特别的壁龛细胞，然后这些壁龛细胞会释 放干细胞所需的蛋白质，保证这些放干细胞所需的蛋白质，保证这些“ “母体母体” ”平稳运行。平稳运行。 Nature, 2007, 448:1015-21 Dr. HendrixDr. Hendrix报道人胚胎干细胞微环境可以诱导恶性黑报道人胚胎干细胞微环境可以诱导恶性黑 素瘤细胞转为正常皮肤细胞表型，并降低侵袭力。素瘤细胞转为正常皮肤细胞表型，并降低侵袭力。 J. FairJ. Fair报道鼠胚胎干细胞可以在体外抑制胰腺癌细胞报道鼠胚胎干细胞可以在体外抑制胰腺癌细胞 生长。生长。 Stem Cells, 2006,24:501-505 J Sur Res, 2004,121:342 胚胎生殖干细胞（胚胎生殖干细胞（EGEG细胞）属于全能干细胞，来源于原始细胞）属于全能干细胞，来源于原始 生殖细胞，本实验设计研究人生殖细胞，本实验设计研究人EGEG细胞对卵巢癌细胞细胞对卵巢癌细胞SKOV3SKOV3 在体内外生长抑制的作用，并设计通过定量在体内外生长抑制的作用，并设计通过定量PCRPCR、western western blot blot 等检测等检测AKTAKT信号通路的表达情况。信号通路的表达情况。 方法与路线方法与路线 胚胎生殖细胞的分离、培养、鉴定 5-7周流产胎儿 生殖嵴 分离原始生殖细胞 接种培养 细胞因子（bFGF、forskolin等)、胚 胎条件培养液、成纤维细胞饲养层等 传代鉴定 （AP，SSEA-1、3、4，OCT-4，TRA-1-60，TRA-1-81等） 直接共培养直接共培养EG cellsEG cells与与SKOV3 cellsSKOV3 cells 研究研究EGEG细胞在体内对卵巢癌细胞生长的作用细胞在体内对卵巢癌细胞生长的作用 利用利用SKOV3SKOV3卵巢癌细胞在卵巢癌细胞在SCIDSCID小鼠皮下建立人卵巢癌的小鼠皮下建立人卵巢癌的 动物模型，在小鼠皮下出现可触到的瘤块时（约在接种后动物模型，在小鼠皮下出现可触到的瘤块时（约在接种后 7 7天，瘤块直径约天，瘤块直径约0.5cm0.5cm），将培养的人胚胎生殖细胞注入），将培养的人胚胎生殖细胞注入 肿瘤组织内，并以肿瘤组织内，并以PBSPBS作为对照，比较两组小鼠肿瘤生长作为对照，比较两组小鼠肿瘤生长 情况。情况。 培养的培养的EGEG细胞呈克隆样生长，边界清楚，似鸟巢状，细胞呈克隆样生长，边界清楚，似鸟巢状，APAP染色阳性。染色阳性。 HEG细胞鉴定 结果 A A： SSEA-1SSEA-1 B: SSEA-3B: SSEA-3 C: SSEA-4C: SSEA-4 D: TRA-1-60D: TRA-1-60 E: TRA-1-81E: TRA-1-81 结果 HEG细胞的鉴定 HEG自发分化 共培养共培养48h48h计数计数SKOV3 cellsSKOV3 cells 实验组：(7.82.4)104 对照组：(11.52.3)104 (p=0.0258) 结果 TUNEL凋亡检测 A、C：实验组 B、D：对照组 免疫细胞化学检测Caspase9的表达 Real time PCRReal time PCR检测检测AKT mRNAAKT mRNA表达表达 结果 Western blotWestern blot检测检测p-aktp-akt、aktakt蛋白的表达蛋白的表达 结果 肿瘤生长曲线 同期观察测量 实验组肿瘤生 长慢于对照组 石蜡组织切片TUNEL凋亡检测 结 论 与生殖干细胞体外共培养后，卵巢癌与生殖干细胞体外共培养后，卵巢癌SKOV3SKOV3细胞的细胞的 生长显著受到抑制；体内注射实验也表明能够抑制生长显著受到抑制；体内注射实验也表明能够抑制 肿瘤生长。肿瘤生长。 TunelTunel结果初步表明：结果初步表明： 此抑制现象可能是通过诱导凋亡途径发生。此抑制现象可能是通过诱导凋亡途径发生。 PI3Ks/AktPI3Ks/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，在人类信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，在人类 肿瘤谱中广泛失调肿瘤谱中广泛失调, , p-AKTp-AKT可以通过激活或抑制下游的受可以通过激活或抑制下游的受 体蛋白体蛋白BADBAD、Caspase 9Caspase 9等，进而调节细胞的增殖、分化、等，进而调节细胞的增殖、分化、 凋亡以及迁移等；本实验结果显示凋亡以及迁移等；本实验结果显示AKTAKT信号通路参与了此信号通路参与了此 诱导凋亡过程，表现为：诱导凋亡过程，表现为： p-AKTp-AKT表达减少，使凋亡抑制被解除；表达减少，使凋亡抑制被解除；caspase-9caspase-9被激活被激活 ，引起，引起SKOV3SKOV3细胞的凋亡。细胞的凋亡。 干细胞对癌细胞的影响是通过胞外分泌形式还干细胞对癌细胞的影响是通过胞外分泌形式还 是细胞接触途径？需进一步验证。是细胞接触途径？需进一步验证。 干细胞表达的产物多种多样，具体是哪些蛋白