绿色生物储粮防护剂多杀菌素可行性研究报告.doc

绿色生物储粮防护剂多杀菌素的开发可行性研究报告一、立项的背景与意义“民以食为天”。粮食问题始终是关系我国国民经济发展和全国建设小康社会的重大战略性问题。粮食安全历来受到我国党和政府的高度重视。特别是近年来随着我国城镇化的加快，耕地面积不断减少，人口不断增加，而粮食单产增幅有限，粮食总产难有大的突破，粮食产后减损已成为保障国家粮食安全的重要手段。粮食储藏安全是粮食产后减损的关键节点之一。粮食在储藏过程中不可避免的受到有害生物特别是储粮害虫的侵染，而导致品质下降，数量减少。据统计全球储粮因害虫造成的损失约为4%，发展中国家高达8-10%。在我国每年因虫害造成的储粮损失超过1200万吨，直接经济损失超过200亿元。我国目前对储粮害虫的防治主要依赖于化学药剂。化学防治具有高效、经济、使用方便等优点，在我国使用十分广泛。特别是熏蒸剂磷化氢作为我国科学保粮的当家药剂，自上世纪60年代引进我国以来，被持续反复使用达50年之久。随着化学农药的长期使用，3r问题（害虫抗性、有害生物再猖獗和农药残留）日益严重，上世纪90年代的新研究成果还表明，我国储粮害虫防治的王牌药剂磷化氢可导致人体细胞染色体畸变(garry等1990)和致癌(alavanja等1990)，化学防治的安全性越来越受到质疑。随着1962年carson的寂静的春天一书出版，人类对使用化学农药开始全面反思，特别是近年来经济与科技的高速发展，人们的环境意识不断增强，减少和停用化学农药的呼声越来越高。绿色环保的害虫防治技术越来越受到人们的重视。目前，世界上研究得比较多，基本技术比较成熟的绿色储粮害虫防治技术主要有低温储藏、气调储藏和生物技术等。低温储藏既能防治储粮害虫，又能延缓粮食陈化，是一种比较理想的技术，但其能耗高，运行成本高，不符合国家节能减排和低碳经济的产业政策，难以在我国推广应用。气调储藏也因运行成本高、对仓房密闭性要求高，不适合我国当前仓储的实际情况，难以广泛应用。生物技术逐渐成为研究的热点，同时生物技术也被认为是人类解决害虫防治问题的最后手段。多杀菌素（spinosad）是一种具有触杀及摄食毒性的新型微生物源杀虫剂，具有对害虫广谱高效、对人、非靶标动物和环境极为安全、可生物降解的优异特点，并因此获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。多杀菌素首先于1997年在美国被批准登记，商品名为tracer，用在棉花上。2005年，多杀菌素已经被批准用于73个国家的250多种作物上。由于多杀菌素能有效防治多种储粮害虫、用药量极少、有效期长、安全高效、低残留，因而被认为是一种极具前景的“绿色”储粮防护剂。在国内，目前对多杀菌素的研究开发还只停留在实验室小试阶段。因此，我国应加快多杀菌素生产技术的开发研究步伐，并结合我国粮食仓储行业的实际情况，进行实仓应用技术的开发，从而减少化学药剂的使用量，延缓储粮害虫抗药性的发生和发展，最终促进我国绿色储粮技术的发展。二、国内外研究现状与发展趋势多杀菌素作为一种生物杀虫剂，兼具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性特点，目前有73个国家已注册在250多种的作物上应用。目前国内外的研究主要集中在以下几个方面：一是多杀菌素的作用机理。美国科学家kirst ha、salgado vl.等研究表明它的作用方式是通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹。这种作用结果和烟碱型乙酰胆碱受体被激活的结果是相一致的，显而易见这一作用机制在已知的害虫防治产品中是新颖和独特的。多杀菌素同时也作用于-氨基丁酸受体，有可能这进一步促成了其杀虫活性的提高，如此的作用模式可谓独一无二。二是多杀菌素的杀虫谱和毒性。多杀菌素属广谱杀虫剂，试验证明多杀菌素能有效地控制鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫。多杀菌素对鳞翅目幼虫的活性大大地大于各种有机磷、氨基甲酸酯杀虫剂，与拟除虫菊酯相当。多杀菌素具有高杀虫活性的同时, 对捕食性昆虫还表现出较低毒性, 对鳞翅目昆虫而言,多杀菌素是已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。多杀菌素属低毒杀虫剂。它对哺乳动物和鸟类相对低毒。对哺乳动物的慢性毒理试验表明多杀菌素无致畸、致突变、致癌作用或神经毒性。三是多杀菌素产生菌株的选育。提高多杀菌素产量可以从两个方面着手，一方面诱变育种改变菌种的遗传背景，获得高产菌种。目前国内学者在刺糖多孢菌菌种选育中常用的常规诱变方法主要有：紫外（uv）诱变，uv和氯化锂（licl）复合诱变，硫酸二乙酯（des）诱变，亚硝基胍（ntg）诱变，des和licl复合诱变，60co诱变等。另一方面给菌种一个最适发酵培养条件，使其产生高效价的性状得以充分表达。摇瓶种子培养基为：葡萄糖，淀粉，精氨酸，黄豆粉，玉米浆，酵母浸出粉，caco3，ph 6.3。28于旋转式摇床(偏心距4cm)160rmin培养72h。摇瓶发酵培养基为：葡萄糖，淀粉，精氨酸，黄豆粉，玉米浆，酵母浸出粉，caco3，ph7.0，28于同条件摇床上培养68d。大规模发酵时优选的碳源为葡萄糖和麦芽糖。优选的氮源为棉子糖、胨化牛奶和消化大豆粉。四是多杀菌素的分离提纯和测定。目前国内对多杀菌素的分离提纯尚未有实质性研究。根据国外文献，多杀菌素主要有溶剂萃取法和hplc跟踪检测法2种分离纯化方法。五是多杀菌素在储粮害虫防治中的应用。近几年，美国堪萨斯大学谷物科学和工业系的bh. subramanyam, m. d. toews和l. fang对利用多杀菌素防治储粮害虫进行了较为详细的研究。1ppm多杀菌素就能完全防治印度谷蛾、麦蛾、谷蠹、杂拟谷盗、锈赤扁谷盗、米扁虫。对米象、赤拟谷盗、锯谷盗、玉米象的防治效果有待于观察。在堪萨斯州试验仓条件下，1ppm 多杀菌素在粮食中可以保持一年。在同样条件下温度从-10到32变化时，没有明显的损失。多杀菌素在水分为12.5到14.5的小麦中的杀虫效果没有什么变化。我国目前几乎没有开展多杀菌素防治储粮害虫的应用研究。曹阳等人测定了2.5%菜喜悬浮剂对嗜虫书虱、锯谷盗和米象三种主要储粮害虫的毒力。结果表明，多杀菌素对这三种主要储粮害虫都有较好的触杀效果，其lc50分别为0.0022、0.0046、0.0059mg/m2，在0.016 mg/m2的浓度下，48小时的防治效果均达90以上。高产菌株的选育、多杀菌素的产业化生产及其在粮食储藏的应用技术研究将是多杀菌素未来研究的重点。三、项目实施主要内容、技术关键与创新点、预期目标1、详细说明本项目实施的主要技术内容，解决的关键技术，描述项目的技术或工艺路线。1.1 高产菌株的选育对多杀菌素产生菌刺糖多孢菌株进行分离复壮，获得遗传性能较稳定的菌株，以此为出发菌株，进行原生质体亚硝酸和微波诱变，然后采用模块替换等技术方法，对多杀菌素基因簇进行改造，构建多杀菌素高产工程菌。高产工程菌发酵单位达到600g/ml 。1.2 发酵培养条件的选择在目前国内外的研究基础上，通过正交试验，选择高产工程菌的摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养基、大规模发酵培养基最佳配方和最适条件。1.3 试验制剂的制备多杀菌素高产工程菌，作为生产菌种进行100l自动发酵罐生产考核，所得的发酵液，适当处理，制成试验制剂。1. 对主要储粮害虫的毒力测定用经过多代饲养的粮库主要的鳞翅目、鞘翅目害虫（如麦娥、印度谷蛾、玉米象、谷蠹、锈赤扁谷盗）作为标靶昆虫，在人工感染的饲料上，进行多杀菌素试验制剂的生物测定，制定适于我国储粮害虫的多杀菌素制剂参照标准。1. 粮食仓储适用型多杀菌素制剂开发通过与植物源杀虫剂蛇床子、印楝素等生物农药的复配筛选，确定复配剂的实验室杀虫效果及实仓防治效果。1. 粮食仓储适用型多杀菌素制剂应用技术研究开展多杀菌素制剂应用于不同地域、不同仓型（高大平房仓、浅圆仓、立筒仓）、不同粮种（稻谷、小麦、玉米）的粮食储藏技术研究，制定操作规程；开展多杀菌素制剂应用于农户储粮的实用技术研究，制定操作规程。解决的关键技术1、采用基因重组技术，从分子水平对多杀菌素基因簇进行改造，构建多杀菌素高产工程菌，具有高产、遗传稳定等优势。2、利用r ed/et同源重组、接合转移等试验技术，转化天蓝色链霉菌和农杆菌等异源宿主菌，达到缩短多杀菌素发酵周期。3、采用多种生物制剂复配，解决了微生物制剂击倒性不强，产生效果慢、杀虫谱存在缺陷的问题。2、重点说明本项目的创新点，包括技术创新、产品结构创新、生产工艺创新、产品性能及使用效果的创新等。2.1采用模块替换等技术方法，从分子水平上对多杀菌素基因簇进行改造，构建多杀菌素高产工程菌，处于国内领先。22利用red/et同源重组、接合转移等试验技术，达到缩短多杀菌素发酵周期处于国内领先。23 开发多杀菌素储粮生物保护剂，填补国内空白。3、说明项目的技术来源，合作单位情况，知识产权归属情况。该技术为湖南省粮油科学研究设计院具有自主知识产权的自创技术。课题承担三方通过协议约定，课题产生的成果、专利和产品均归湖南省粮油科学研究设计院所有。4、说明项目实施各阶段及项目完成后预期取得的主要技术成果（包括新技术、新工艺、新产品等）技术水平及相应技术指标等。产业化项目可以是成果工程化或中试成果，以及产业化过程中的技术创新、产品创新、机制创新等。基础研究项目主要是学术论文、著作等。4.1建立完整配套的多杀菌素绿色杀虫农药中试研究与产品开发基地；4.2开发形成1种效价10000iu/mg-20000iu/mg粉剂的多杀菌素绿色储粮保护剂；4.3参照现有国家标准，制定适于我国储粮害虫的多杀菌素制剂参照标准。4.4申请国家发明专利1-2项。4.5发表论文3-4篇。四、应用或产业化前景与市场需求我国是世界上最大的粮食生产、消费大国。每年粮食生产量达到5亿吨。目前我国粮食储藏害虫防治是以磷化氢熏蒸剂为主的化学防治，随着社会的发展，人们的环境意识不断增强，化学农药必将被淘汰，绿色环保的害虫防治技术越来越受到人们的重视。多杀菌素生物制剂作为一种绿色生物技术被认为是21世纪最有前景的储粮害虫防治技术，将逐渐取代磷化氢成为我国3000大中型粮库和3亿吨农户储粮的当家药剂，因此市场前景十分广阔。五、现有工作基础、条件和优势1、开展的前期研究从2009年起，我单位就开展了以乙基多杀菌素为有效成分的储粮防护剂防治常见储粮害虫研究，结果见表1、2、3。表1、从表1中可以看出，1ppm多杀菌素就能完全防治印度谷蛾、麦蛾、谷蠹、杂拟谷盗、锈赤扁谷盗、米扁虫。对米象、赤拟谷盗、锯谷盗、玉米象的防治效果有待于观察。多杀菌素在玉米中防治赤拟谷盗和锯谷盗、米象、玉米象比在小麦中防治效果好。表1 多杀菌素作为储粮防护剂（1mg/kg）在实验室的效果虫种硬红春麦硬红冬麦玉米成虫死亡率卵孵化率幼虫死亡率49天后成虫出现率粮粒破坏率12天后幼虫死亡率49天后成虫死亡率49天后粮粒破坏率印度谷蛾010000/麦蛾000/谷蠹1000100001001000杂拟谷盗100010042/锈赤扁谷盗1000100001001000米扁虫1000/米象100259801.51001000赤拟谷盗2501006284942.4锯谷盗6592/1001000玉米象359599001001000多杀菌素通过破坏储粮害虫的各个虫态来防止害虫侵袭及其后代的生长，因此，在实验室的研究不能完全说明它的防治效果。长期研究表明，在仓库条件下，多杀菌素重点是对害虫种群的影响和对整个生活史的控制。表2 多杀菌素作为储粮防护剂（1mg/kg）的实仓实验研究结果12周24周36周48周96周谷蠹成虫10010010099100第一子代1009999100赤拟谷盗成虫32000第一子代99999090锈赤扁谷盗成虫991001009899第一子代9999100100印度谷蛾幼虫10010010098100在试验仓条件下，1ppm 多杀菌素在粮食中可以保持一年。在同样条件下温度从-10到32变化时，没有明显的损失。多杀菌素在水分为12.5到14.5的小麦中的杀虫效果没有什么变化。表3 多杀菌素作为储粮防护剂（1mg/kg）实验总结成虫控制子代控制印度谷蛾米蛾粉斑螟麦蛾谷蠹杂拟谷盗锈赤扁谷盗米扁虫米象 - 赤拟谷盗锯谷盗 - 玉米象 - 注：表示1ppm多杀菌素几乎可以完全控制害虫。实验室研究和实仓实验研究已经表明大部分储粮害虫种类只需1ppm 多杀菌素就能通过破坏其生活史来达到防治效果。1ppm 多杀菌素肯定能防治的害虫有：印度谷蛾、米蛾、其它鳞翅目害虫、谷蠹、锈赤扁谷盗、米扁虫、杂拟谷盗。 2、条件和优势2.1 人员条件该课题负责人既有扎实的理论基础，又有丰富的实践经验，参加过多项国家重点科技攻关计划课题，在湖南生物药厂从事生物农药研究、生产、应用20多年，对微生物农药生产流程十分熟悉。该课题主要研究人员大都主持、承担或参加过国家重点科技攻关计划课题和社会公益性课题，均有大专以上学历，有的还是本行业的学术权威和学术带头人，年龄结构合理，老中青结合。 2.2资金条件课题承担单位对该课题非常重视，承诺从自有资金中配套120万元，用于支持本课题的研究，并保证课题经费的专款专用。2.3设施条件该课题承担单位长期从事粮油储藏科学研究，拥有高效液相色谱仪、气相色谱仪、原子吸收分光光度计、pcr仪、微电泳等完成该研究的基础设备，以及微生物培养室、生化研究室和270亩的中试转化基地，为该课题的实施奠定了坚实的基础。六、项目实施方案、组织方式与课题分解1、实施方案、组织方式在湖南省科技厅的指导、监督下，由湖南省粮油科学研究设计院主持，湖南省粮油质监中心和中储粮宁乡直属库协助承担部分试验。在课题承担单位与项目下达单位签订任务书的基础上，课题承担三方签订项目实施责任书，明确三方在的权利、责任和义务，定期开展课题情况信息交流，互相监督。2、管理措施在课题研究实施过程中，严格按照科技部、财政部、国家计委、国家经贸委下达的关于国家科研计划实施课题制管理的规定的具体要求，加强课题的组织管理和经费管理。（1）服从课题组织单位（归口部门）的管理、指导和监督，实行重大事项报告制度。（2）实行目标管理制。课题承担单位责任人分别与课题下达单位签订目标管理责任书，确保各项攻关任务落到实处。实行定内容、定目标、定人员、定组织保障措施。（3）组建以国内知名的粮食储藏专家组成的专家顾问组，负责课题实施方案审查、技术指导、技术咨询等事项。（4）实行全程跟踪管理。课题组织单位和技术专家顾问组定期或不定期对课题执行情况进行检查，确保项目顺利实施。（5）建立激励机制。根据目标任务完成情况，实行奖优罚劣，充分调动各方面的积极性。（6）成立联合攻关课题组。跨部门、跨单位择优聘用课题组成员，组成一个结构精干、人员相对稳定的课题组，分工明确、职责分明。（7）确保专款专用。加强经费管理，保证国拨经费和地方匹配经费及时足额到位，合理使用。 3、课题分解表4、课题分解课题名称课题依托单位负责人建议经费（万元）高产菌株的选育湖南省粮科院朱邦雄50发酵培养条件的选择湖南省粮科院覃世民30对主要储粮害虫的毒力测定湖南省粮油产品质量监测中心陈渠玲30粮食仓储适用型多杀菌素制剂开发湖南省粮科院邓树华40试验制剂的制备湖南省粮油产品质量监测中心倪小英30粮食仓储适用型多杀菌素制剂应用技术研究湖南省粮科院周剑宇40七、进度安排与年度计划内容1、2010年6月8月，申报、立项；2、2010年6月12月，高产菌株的选育，发表论文1篇；3、2011年1月4月，发酵培养条件的选择，发表论文1篇；4、2011年4月6月，试验制剂的制备，申请专利1项；5、2011年6月12月，对主要储粮害虫的毒力测定；6、2012年1月6月，粮食仓储适用型多杀菌素制剂开发，发表论文1篇；申请专利1项；7、2012年6月2013年5月，粮食仓储适用型多杀菌素制剂应用技术研究，发表论文1篇，8、2013年6月，课题总结，验收。八、承担单位和主要研究人员简况1、承担单位基本情况湖南省粮科院是专门从事粮油储藏、粮油工程设计、粮油产品质量监测的综合性科研、设计机构，拥有从美国、日本、瑞士等国家进口的高精密仪器设备，具备基本的微生物检验、育种和小型发酵设备。目前，正承担“十一五”国家科技支撑计划重大项目“长江中下游平原稻谷产区农户储粮减损技术集成与示范”和“农村储粮防虫、防鼠关键技术研究与示范”两个子课题。同时，在国家高技术研究发展计划(863)“稻米绿色供应链技术创新与设备研制”项目中，还承担着“绿色供应链储运技术”子课题。我院参与的“十五”国家科技攻关项目“长江中下游平原稻谷产区农户储粮减损技术集成与示范”，2008年获中国粮油学会科学技术进步一等奖。近两年来获国家发明专利及实用新型专利5项。院内设有储藏研究所，有从事过生物制剂研究、生产、销售20多年的专业人员，因此，从人员、技术、设备都具备承担该类课题的基础条件。2、课题负责人基本情况朱邦雄，男，52岁，副研究员，中山大学生物学系昆虫学专业毕业，有水稻害虫、蔬菜害虫、储粮害虫的综合防治的经历和经验，曾在湖南生物药厂从事生物农药研究、生产、应用20多年，并担任负责人。2.1 1999-2002年，在国家早稻品质改良科技产业工程项目中，主持并完成“仓虫敌储粮防护剂研制”课题任务，开发出具有触杀、胃毒和一定的熏蒸作用的“仓虫敌”，是目前国库和农户储粮防虫的重要药剂。2.2 2004-2006年，在“十五”国家科技攻关重大项目“粮食丰产科技工程”中，主持“长江中下游平原稻谷产区农户储粮减损技术集成与示范”课题湖南、江西研究工作，圆满完成任务，通过了科技部的验收。2.3 2006年起，在“十一五”国家科技支撑计划重大项目“粮食丰产科技工程”（产后）中，主持“长江中下游平原稻谷产区农户储粮减损技术集成与示范”课题的湖南任务，负责“农村储粮防虫、防鼠关键技术研究与示范”课题的技术指导，目前两课题进展顺利。2.4 2008年起，承担国家高技术研究发展计划(863)“稻米绿色供应链技术创新与设备研制”项目的“绿色供应链储运技术”子课题，目前课题进展顺利。2.5 曾获“中国粮油学会科学技术进步一等奖”、湖南省政府重大科技进步三等奖等多项奖励，2008年来获国家专利多项，在昆虫学报、粮食储藏等刊物上发表10余篇论文；现在为湖南省昆虫学会理事。3、主要研究人员表5、主要研究人员情况课题承担单位：湖南省粮油科学研究设计院主要参加单位：湖南省粮油产品质量监测站中储粮宁乡直属库课题负责人：朱邦雄姓 名性别年龄职务职称业务专业本项目工作时间(%)所在单位朱邦雄男52所长/副研 昆虫学80湖南省粮科院储藏所覃世民男43院长/研究员食品科学与公共管理30湖南省粮科院陈渠玲女44副主任/高工粮油检验40湖南省粮油产品质量监测中心邓树华男34副所长/助研 生物化学60湖南省粮科院储藏所李女38博士农药化学60湖南省粮科院储藏所周剑宇男35工程师粮食储藏70湖南省粮科院储藏所吴树会男25硕士粮食储藏70湖南省粮科院储藏所倪小英女35实验师粮油检验50湖南省粮油产品质量监测中心九、经费预算来源、使用计划项目总投资240万元，其中项目承担单位湖南省