论文-利用玉米秸秆水解液发酵生产2,3丁二醇.pdf

浙江大学化学工程与生物工程学系 硕士学位论文 利用玉米秸秆水解液发酵生产2，3-丁二醇 姓名：司阳 申请学位级别：硕士 专业：生物化工 指导教师：夏黎明 20100101 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 2 , 3 一丁二醇是重要的化工原料及液体燃料，利用生物质转化生产2 ，3 丁二醇 是替代传统化工合成的一种可行途径。由于石油资源的日渐紧缺，利用廉价的木 质纤维作为原料发酵生产2 ，3 丁二醇更具有竞争力和应用价值，本文以玉米秸秆 作为初始原料，研究了预处理、纤维素酶解、单批发酵、分批补料发酵、同步糖 化发酵等各环节的关键技术参数，研究结果对于促进非粮食原料的生物转化利用 具有重要意义。 对玉米秸秆的预处理技术进行了研究，结果表明：稀酸处理可以脱除大部分 的半纤维素，稀碱处理可以脱除大部分的木质素。纤维素酶水解实验结果表明： 碱处理后玉米秸秆酶解液中的单糖含量较高，主要得益于木质素的高脱除，以及 润张后的纤维素成分更容易被纤维素酶所降解，稀碱预处理是一种有效的预处理 方案。 预处理过程引入了无机盐，当代表性无机盐n a 2 s 0 4 浓度低于2 0g l 时，对 后续发酵无明显影响。乙酸和乙醇是主要的发酵副产物，当浓度分别超过2 0 班 和5 l 时，会对菌株生长产生明显抑制作用。 发酵适宜的初始p h 值为6 0 - , 6 5 ，总糖浓度为8 0 - - , 1 0 0g l 产酸克雷伯菌 k l e b s i e l l ao x y t o c az u 0 3 利用秸秆纤维素水解液单批发酵实验表明，在总糖浓度 8 0 l ，3 0 。c 的条件下发酵6 4h ，总糖利用率可达到9 9 3 6 ，2 ，3 t - 醇的质量 浓度为3 7 2 0g l ，产率为0 4 6 8g g ，达到理论产率的9 3 6 在此过程中实现 了来自半纤维素和纤维素的五碳糖和六碳糖的共利用。 单批发酵中出现的底物抑制瓶颈可以通过分批补料策略来克服。研究表明1 2 h 是比较合适的补料起始时间，比较合适的单次补料量是1 5g l 。补料成分的较 佳碳氮比为1 6 ，连续发酵2 0 4h 产物浓度达到1 0 0 1 4g l ，最高产量达到1 0 8 1 3 g l ，相对于单批发酵，产量提高了1 9 0 7 ，通过分批补料操作获得了较高的产 物浓度，对于降低下游的分离成本具有实际价值。 同步糖化发酵法( s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ，s s f ) 生产 2 ，3 丁二醇整合了酶解和发酵两个重要环节，不但省去了酶解液处理步骤，而且 提高了生产效率，降低了成本。k l e b s i e l l ao x y t o c az u 0 3 利用纤维原料同步糖化 发酵生产2 ，3 t - - 醇的适宜的温度为3 1 。c ，初始p h 值为6 0 ，纤维素酶的合适 浙江大学硕士学位论文 摘要 用量为2 5f p i u g 底物，纤维二糖酶用量是2 0c b i u g 底物，s s f 进行3 6h ，发 酵液中2 ，3 丁二醇的浓度为2 3 3 0g l ，产率为0 2 3g g 底物。 利用玉米秸秆水解液发酵生产2 ，3 丁二醇，实现了农业废弃物的再利用。和 化学合成相比，生物转化过程相对比较温和，因此对设备的损耗和能源的需求较 低。发酵得到了有用的化合物2 ，3 丁二醇。此过程的研究为促进可降解废弃物的 生物转化和利用开拓了一个新的方向。 关键词：玉米秸秆；预处理；纤维素；半纤维素；酶水解；2 ，3 一丁二醇；分 批补料发酵；同步糖化发酵 i i 浙江大学硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t 2 , 3 一b u t a n e d i o li sav a l u a b l ec h e m i c a lf e e d s t o c ka n dl i q u i df u e l b i o l o g i c a l p r o d u c t i o no f2 , 3 一b u t a n e d i o lf r o mb i o m a s si saf e a s i b l ea l t e r n a t i v ef o rt r a d i t i o n a l c h e m i c a ls y n t h e s i s b e c a u s eo ft h ei n c r e a s i n gs h o r t a g eo fo i lr e s o u r c e s ，f e r m e n t a t v e p r o d u c t i o no f2 , 3 - b u t a n e d i o lf r o mc h e a pl i g n o c e l l u l o s em a t e r i a l sb e c o m em o r ea n d m o r ec o m p e t i v ea n dp r a c t i c a b l e t h i sa r t i c l es t u d i e st h ek e yt e c h n i c a lp a r a m e t e r si n p r e t r e a t m e n t ，c e l l u l o s eh y d r o l y s i s ，b a t c hf e r m e n t a t i o n ，f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ， s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o na n do t h e ra s p e c t su s i n gc o r ns t o v e ra s t h ei n i t i a lr a wm a t e r i a l s ，t h er e s u l t sh a v es o m e s i g n i f i c a n c ei np r o m o t i n g b i o t r a n s f o r m a t i o no fn o g r a i nb i o m a s s p r e t r e a t m e n to fc o r ns t o v e rh a sb e e ns t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a ta c i dt r e a t m e n t c a nr e m o v em o s to ft h eh e m i c e l l u l o s e ，w h i l ei na l k a l it r e a t m e n t sal a r g ep r o p o r t i o n o ft h el i g n i ni sr e m o v e d e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc e l l u l o s ee x p e r i m e n t ss h o wt h a t h y d r o l y s a t ef r o ma l k a l it r e a t m e n tr e s i d u ec o n t a i n sm o r em o n o s a c c h a f i d e ，m a i n l yd u e t ot h eh i g hl i g n i nr e m o v a lr a t e i na d d i t i o n ，t h ec e l l u l o s e c o m p o n e n ti se a s i l y h y d r o l y z e da f t e rw e t t i n ga n de x p a n s i o n d i l u t ea l k a l ip r e t r e a t m e n ti sa ne f f e c t i v e p r e t r e a t m e n tm e t h o d p r e t r e a t m e n tp r o c e s sw o u l di n t r o d u c ei n o r g a n i cs a l t st oh y d r o l y s a t ea n d n a 2 s 0 4 i sat y p i c a lo n e s o d i u ms u l f a t ec o n c e n t r a t i o nu n d e r2 0g li nt o ms t o v e rh y d r o l y s a t e h a sn os i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo ns u b s e q u e n tf e r m e n t a t i o n ；a c e t i ca c i da n de t h a n o l ，a s t h em a i nb y p r o d u c t s ，a f f e c t st h ef e r m e n t a t i o na st h ec o n c e n t r a t i o ne x c e e d s2 0a n d5 g lr e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a li n i t i a lp hi s6 0 - 6 5a n dt h ei n i t i a lt o t a l s u g a rc o n c e n t r a t i o ni s 8 0 10 0g l b a t c hf e r m e n t a t i o no nh y d r o l y s a t eb yk l e b s i e l l ao x y t o c az u 0 3s h o w s w h e nt h et o t a ls u g a rc o n c e n t r a t i o ni s8 0g l ，t h ec u l t u r e sa r es h a k i n ga t3 0o cf o r6 4h ， a2 , 3 - b u t a n e d i o lc o n c e n t r a t i o no f3 7 2 0g li sa c h i e v e da n d9 9 3 6 o ft h et o t a ls u g a r i sc o n s u m e dw i t ht h ey i e l do f0 4 6 8g g ，w h i c hr e a c h e d9 3 6 o ft h et h e o r e t i c a l m a x i m u m c o m m o nu t i l i z a t i o no fp e n t o s ea n dh e x o s e f r o ms e m i c e l l u l o s ea n d c e l l u l o s ei sa c h i e v e di nt h i sp r o c e s s t h es u b s t r a t ei n h i b i t i o nb o t t l e n e c ki nb a t c hf e r m e n t a t i o nc a nb eo v e r c o m e db y f e db a t c ho p e r a t i o n s t u d ys h o w ss u b s t r a t e s u p p l e m e n ts h o u l ds t a r ta t12ha n d a p p r o p r i a t ea d d i t i o nm o u n ti s 15g le a c ht i m e t h ep r o p e rs u p p l e m e n t a lc a r b o n n i t r o g e nr a t i oi s 16 2 , 3 一b u t a n e d i o lc o n c e n t r a t i o nr e a c h e d10 0 14g li n2 0 4ha n d 1 1 1 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t _ m a x i m u mo u t p u ti s10 8 13g lw h i c hi n c r e a s e d 19 0 7 t ot h eb a t c hf e 肿e n t a t l o m h i g hp r o d u c tc o n c e n t r a t i o ng e n e r a t e db y f e db a t c hf e r m e n t a t i o nh a 5 av a i u ef o 。 s a v i n gt h ec o s to fd o w n s t r e a ms e p a r a t i o no f2 ，3 一b u t a n e d i o l s i m u l t a n e o u s s a c c h a f i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ( s s f ) o f2 , 3 b u t a n e d l o l i n t e g r a t e st w om a j o rs e g m e n t s ：h y d r o l y s i sa n df e r m e n t a t i o na n ds a v e d t h eh y d r o l y s a t e p r o c e s s i n gs t e p ，w h i c hi m p r o v e sp r o d u c t i o ne f f i c i e n c ya n d l o w e r sc 0 8 t s l h eo p t l m a l i n i t i a lp ho fs s fb yk l e b s i e l l ao x y t o c az u 一0 3i s6 0a n ds u i t a b l et e m p e r a t u r e i s31 。c t h ea p p r o 研a t ec e l l u l a s ea n dc e l l o b i a s ed o s a g ei ns s f i s2 5f p i u ga n d12 - 5c b i u g ， r e s p e c t i v e l y 2 , 3 - b u t a n e d i o lc o n c e n t r a t i o nr e a c h e d2 3 3 0g lw i t ht h ey i e l d 0 2 3g g a f t e r3 6hf e r m e n t a t i o n f e 册e n t a t i v ep r o d u c t i o no f2 ，3 一b u t a n e d i o lm a k e st h er e u s eo fa g r i c u l t u r a lw a s t e p o s s i b l e b i o c o n v e r s i o np r 。c e s si sr e l a t i v e l ym i l dc o m p a r e dw i t hc h e m i c a l s ) ，l l t h e s i s ， t h e r e f o r e ，t l l ew a s t a g eo fe q u i p m e n t sa n de n e r g yc o n s u m p t i o n i sl o w e r au s e m l c o m p o u n d2 , 3 - b u t a n e d i o l i so b t a i n e di nt h ep r o c e s s t h i ss t u d yp r o m o t e s t r a n s f o 蛐a t i o no fb i o d e g r a d a b l ew a s t ea n do p e n sa n e wd i r e c t i o n k e y w 。r d s ：c o r ns t o y e r ；p r e t r e a t m e n t ；c e l l u l o s e ；h e m i 。c e l l u l 。s e ；e n z ) 彻a t i c h y d r o l y s i s ；2 , 3 - b u t a n e d i o l ；f e db a t c hf e r m e n t a t i o n ；s s f i v 浙江大学硕士学位论文 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也巧i 包含为获得逝至三盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：司固 签字日期： 沙t 。年弓月1 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的伞部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 7 一、 刽阳 导师签名： 签字日期：砂旧年弓月l - 日 签字日期： fp 年弓月乞罗 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 光阴荏苒，我即将完成硕士阶段的学 - j 。在过去的两年多中，浙江大学给我 提供了良好的学 - - j 平台，帮我树立了完善的人生价值观和科学的研究态度，这为 我今后的工作学 - - j 打下了坚实的基础，是我取之不尽的财富。 首先我要感激我的导师夏黎明教授，夏老师渊博的学识、严谨的治学态度以 及诲人不倦的精神让我受益匪浅。在攻读学位期间，我有幸聆听夏老师关于科研 工作的谆谆教导，感受到他对我学 - - j 生活各方面的殷殷关怀。特别是夏老师帮助 我培养了科学的，热情的工作态度，开拓了创新的思维境界。在论文完成之际， 谨向夏黎明教授致以崇高的敬意和衷心的感谢! 还要感谢实验室各位同学的支持和帮助。本课题组良好的学术交流气氛，让 我在较短时间内弥补了差距。同学们的建议给我的课题进展提供了灵感。特别感 谢金欣博士对于本篇论文的细心修改，她严谨的态度和专业的精神促成了论文的 顺利完成。还要感谢赵晶、王冰冰、高岚、吕雄、李武岳、冀彤、孟楠，帅永鑫、 叶雪丹、吴开明等，他们在实验设计、准备和科技文献写作等方面给了我帮助与 指导，非常感谢你们。 我的父母给予我最无私的关怀，他们一直在鼓励我奋发进步，唯有感叹，谁 言寸草心，报得三春晖! 最后，我向所有曾经关心和帮助过我的老师，同学和朋友致以谢意，多谢你 们的支持和鼓励，我才能够充满信心的把握现在，面对未来，争取辉煌的成绩。 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 2 ，3 丁二醇是一种应用前景广泛的化合物，利用生物质转化生产2 ，3 丁二醇 是替代传统化工合成法最可行的途径，随着石油资源的逐渐减少和开采成本的上 升，生物法转化生产2 ，3 丁二醇重新受到了各国工业界和科研机构的重视。正因 为2 ，3 丁二醇拥有广泛的应用前景( 生物燃料、增塑剂、生产合成橡胶、增加燃 料辛烷值等) ，利用微生物转化生物质原料生产2 ，3 丁二醇拥有广泛的应用价值， 并顺应国家大力发展新能源的政策，对我国经济社会可持续发展有重要的意义。 1 12 ，3 一丁二醇概况 2 ，3 - 丁二醇( 2 ，3 - b u t a n e d i o l ，2 ，3 - b u t y l e n eg l y c o l ，d i m e t h y l e n eg l y c o l ， 2 ，3 - d i h y d r o x y b u t a n e ) 是丁二醇的一个同分异构体，分子式为c 4 h i 0 0 2 ，分子量 为9 0 1 2 1g m o l ，常温下密度0 9 8 7g m l ，沸点为1 7 7 1 8 2o c ，燃烧值为2 7 1 9 8j 儋。2 ，3 一t - 醇有三种光学异构体：d ( 一) 型，l ( + ) 型，内消旋型，如图l 所示， 三种异构体的沸点略有不同。2 ，3 丁二醇是一种大宗化学品，广泛应用于化工、 食品、燃料和航空航天领域，是石油替代战略中的重要平台化合物。早在1 9 0 6 年，h a r d e n 和w a l p o l e t l 】就尝试利用k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 生产2 ，3 丁二醇，上世 纪三十年代f u l m e r 2 】等人提出工业化生产2 ，3 丁二醇的设想，二战期间，利用生 物质转化生产2 ，3 丁二醇受到了重视。5 0 年代后，由于石油工业的高速发展，生 物质的转化逐渐让位于价格更加低廉的石化产品。当前，随着石油的紧缺和价格 的上升，利用生物质原料生产2 ，3 丁二醇重新受到重视。2 ，3 丁二醇的主要应用 之一是转化为l ，3 丁二烯，后者是橡胶合成中重要的中间体。2 ，3 丁二醇的凝固 点只有6 0o c ，因此可以作为抗冻剂。2 ，3 丁二醇的脱氢产物双乙酰具有奶油味， 可以作为香料，同时具有抑菌的效果，因此是良好的食品添加剂。2 ，3 一丁二醇的 脱水产物甲基乙基酮( m e t h y le t h y lk e t o n e ，m e k ) 具有很高的热值，可以用作 燃料添加剂，同时也是一种良好的溶剂，可以应用于树脂领域。2 ，3 丁二醇还可 以用于制造墨水、香水、烟熏剂、保湿剂、柔顺剂、增塑剂以及作为药物载体等， 应用前景非常广泛。 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 o hoh oh l + 2 3 - b o d e x t r o r o t a t o r yt o r m 1 2 s 3 s j oh h 乒。入 ：c h 3 o h o + 卜2 3 - b d l e v o r o t a t o r yf o r m ( 2 r 3 r ) 图1 12 , 3 丁二醇的三种光学异构体 f i g1 1t h es t e r e o i s o m e r so f2 ，3 - b u t a n e d i o l 1 1 1 微生物生产2 ，3 丁二醇的代谢途径 在微生物中，2 ，3 丁二醇是通过2 ，3 丁二醇发酵途径形成的，中间体包括a 乙酰乳酸( a a c e t o l a c t a t e ) 、乙偶姻( a c e t o i n ) 、双乙酰( d i a c e t y l ) ，如图1 2 所示， 混酸过程形成的副产物包括甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和乙醇。随着菌种和发酵 条件的不同，副产物的种类和组成会有很大的变化。 口l u c o 2 2 a t p 。 l ( 州2 盼n a d h 一一i 叶 2 2 洲2n a d h - - 、歹弋2 n 伊 2p y r t w a t e 。一 0 2 c o = 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 催化生成乳酸。在n a d h 不足时，则经a 乙酰乳酸合成酶( 0 【a l s ) 催化脱羧 形成a 乙酰乳酸。c t 乙酰乳酸有两条代谢途径，一是经a 乙酰乳酸脱羧酶 ( 仅a l d ) 催化脱羧形成乙偶姻，二是自发脱羧形成双乙酰，再经双乙酰还原酶 ( d a r ，或称乙偶姻还原酶) 催化形成乙偶姻。最后丁二醇脱氢合成酶( b d h ) 催化乙偶姻形成2 ，3 丁二醇。据报道，低浓度的乙酸盐对于上述过程中的三种关 键酶都具有诱导作用【3 】。由于这些酶类都是在发酵的指数期后期和稳定期合成 的，而此时的溶氧条件是限制因素。 z p y r u v o l o m1 l s ， o , 翻= e t o t a c t a t l e c n 1 s p o m 啪。 锄 ：) l 队r 认口， 2i 瑚r u v a t e a - a l s 卜c 0 2 t t 4 c 冶l o l a c l a l e a - a l d 厂、c o ： l r e l o l n 2 , 3 b db 1 0 5 y n t h e s l 5 l a c e t o i n a f ilg 2 - 3 b d 图1 32 。3 丁二醇的代谢途径a - a l s ：c l 乙酰乳酸合成酶 0 【a l d ：a 乙酰乳酸脱羧酶： d a r ：双乙酰还原酶 a r ：乙偶姻还原酶 f i g1 3m e t a b o l i cp a t h w a y so f2 3 一b dp r o d u c t i o nf r o mg l u c o s e 0 【一a l s ：a - a c e t o l a c t a t es y n t h a s e ； a a l d ：旺- a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e ； d a r ：d i a c e t y lr e d u c t a s e a r ：a c e t o i nr e d u c 切s e 1 1 22 , 3 丁二醇生产的菌种 乎三 佻 。 e 亏| + b 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 自然界中有很多细菌可以生产2 ，3 丁二醇，包括产气气杆菌a e r o b a c t e r d e r o g e n e s 4 1 ，解淀粉芽孢杆菌b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c 砌0 5 1 ，地衣芽孢杆菌b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s t 6 1 ，多黏芽孢杆菌b a c i l l u sp o l y m y x a 7 8 1 ，多黏类芽孢杆菌 p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a 【9 1 ，产气肠杆菌e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s 10 1 ，阴沟肠杆菌 e n t e r o b a c t e rc l o a c a e 】，产酸克雷伯氏菌k l e b s i e l l ao x y t o c a 1 2 ，13 1 ，肺炎克雷伯氏 菌k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e t 4 ，15 1 ，黏质沙雷氏菌s e r r a t i a 坍口比四c p 淞【16 1 。在这些细菌 中，产酸克雷伯氏菌( k i e b s i e l l ao x y t o c a ) 和多黏芽孢杆菌( b a c i l l u s p o l y m y x a ) 具有较好的应用前景，前者的优势在于可以利用广泛的底物利用范围，可以利用 木糖【13 1 ，糖蜜【1 2 1 作为发酵的原料。而多黏芽孢杆菌生产2 ，3 丁二醇的能力不如产 酸克雷伯氏菌，但可以分泌淀粉酶【1 7 】，因此可以直接利用淀粉类发酵生产2 ，3 t - 醇，多黏芽孢杆菌另外一个优势在于生产的2 ，3 丁二醇是单一d 型【1 8 ，1 9 1 。 此外，基因工程改造的菌种也受到了重视，s a d a h a r uu i 等将k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 中包含内消旋2 ，3 丁二醇代谢的三个关键酶( a l s ，a l d c 和m e s o b d h ) 基因 的片段插入载体p u c l l 8 之后转入大肠杆菌j m l 0 9 ，结果大肠杆菌在含有葡萄糖 的l b 培养基只产生内消旋2 ，3 丁二醇【2 们，而k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 产生的2 ，3 丁二醇是l 型和内消旋型的混合物。 1 1 32 ，3 丁二醇生产底物的选择 微生物可以利用多种糖类发酵生产2 ，3 一丁二醇，其中六碳糖葡萄糖是最 常见的一种，其它还有木糖、阿拉伯糖、核糖等五碳糖。l e e 用乳清渗透液作为 发酵原料，得到了7 5 l 的2 ，3 丁二醇，将原料中的乳糖酶解为半乳糖后，2 ，3 丁二醇的产量达到了1 3 7g 刖”】。a f s c h a r 通过b a c i l l u s p o l y m y x a 直接转化淀粉， 采用k l e b s i e l l ao x y t o c a 菌株利用搪蜜生产2 ，3 丁二醇，后者的产物浓度达到了 9 9 1 0 0g l ，转化率达到0 5g g 7 1 ，在后续研究中利用回收细胞发酵糖蜜，2 ，3 丁二醇产量达到1 1 8g l 12 1 。 使用低廉生物质原料生产2 ，3 丁二醇广受人们关注。这些生物质原料主要包 括木质素、纤维素和半纤维素等。纤维素是d 葡萄糖的聚合物，而半纤维素主 要包含d 木糖、l 阿拉伯糖和d 一核糖等五碳糖。生物质原料来源广泛，价格低 廉且具有再生性，是2 ，3 丁二醇工业化并最终替代石油化工生产的理想原料。克 雷伯氏菌( k l e b s i e l l a ) 以经酸处理的木质半纤维素为底物发酵生产2 ，3 丁二醇，得 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 到高达0 4 0 5g l 的转化率，主要原因很可能是由于k l e b s i e l l a 菌属可以同时发 酵利用木质半纤维素中存在的半乳糖、d 葡萄糖酸( d g l u c u r o n i c ) 和d 半乳糖醛 酸( d g a l a c t u r o n i ca c i d ) 。 木质纤维素是生物圈中含量最为丰富的有机物质，其化学组成主要包括纤维 素，半纤维素和木质素，此外还包括少量的果胶和腊等。三种主要组成物质在木 质纤维素中所占的比例随着植物种类的不同而表现出明显的差异。一般说来，纤 维素占木材干重的4 5 ，半纤维素约占2 5 。3 0 ，木质素约占2 5 3 0 【2 1 1 。 但木质纤维素的降解存在着一系列的难点，木质纤维素作为植物细胞壁的主要组 成成分，经过亿万年的进化已经具有很强的自我保护功能。它通过3 种主要组分 之间的多种相互作用，形成复杂的空间结构，具有很强的抗酸、抗碱、抗酶解的 能力。因此，常用的的物理、化学和微生物方法的降解效果都不太理想。同时， 水解过程中会产生一些抑制微生物生长的物质。因此，能够利用木质纤维素降解 产物进行生物转化的菌种除了要求具有较宽泛的底物利用范围之外，还需要有较 强的耐受性【2 2 1 ，其中k l e b s i e l l ao x y t o c a 、k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 和b a c i l l u sp o l y m y x a 是较为理想的选择。 vm l a u b e 等 2 3 1 曾利用b a c i l l u sp o l y m y x a 转化半纤维素的各种组分包括木 糖、甘露糖、半乳糖、l 阿拉伯糖以及纤维二糖、淀粉等转化生产2 ，3 丁二醇。 y u 等【2 4 】人利用木材半纤维素水解液作为碳源，以k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 作为转 化菌株发酵生产2 ，3 t - 醇。c a o 等【2 5 1 先用碱浸泡法去除玉米芯中的木质素，再 用酸水解方法去除了半纤维素( 如图1 4 ) 。用剩下的固体( 含9 0 纤维素) 作 为同步糖化发酵( s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ，s s f ) 的原料， 最终得到2 5g l 的2 ，3 丁二醇和7g l 的乙醇。 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 玉米芯( 含水量8 ) 2 1 0 碱溶液中浸泡2 4h 3 a 碱溶液 3 b 纤维素和半纤维索3 c 木质素 0 4 1 的盐酸预处理，1 0 0 - - 1 0 8 ，1h 4 a 玉米：卷纤维素 4 b 水米：卷半纤维素水解液 上 5 a 同步糖化发酵( s s f ) 厂 2 3 丁二醇乙醇 0 5 b 发酵 2 ，3 丁二醇木糖醇 乙醇 图1 4 玉米芯预处理、纤维素水解液发酵及同步糖化发酵过程 f i g1 4p r e t r e a t m e n to fg r o u n dc o mc o b ，f e r m e n t a t i o no nc e l l u l o s eh y d r o l y s a t e a n ds s f ( s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ) 1 2 影响微生物发酵生产2 , 3 丁二醇的因素 1 2 1p h 值的影响 p h 值在调节细菌的代谢过程中起着重要的作用，尤其是在含有大量复合产 物的发酵过程中，p h 对发酵结果的影响尤为明显。2 ，3 丁二醇发酵过程中含有相 当多的副产物，如3 羟基丁酮、乙醇、乙酸、乳酸等。2 ，3 丁二醇生成路线以及 这些副产物生成路线的相关酶的最适p h 并不一致，此外菌体生长的最适p h 和 2 ，3 丁二醇产生的最适p h 也并不一定相同。对于不同菌种，不同代谢底物最适 p h 也是不同的。一般来说，碱性条件有利于有机酸的生成，此时2 ，3 丁二醇的 产量较低。而在酸性条件下，有机酸的产量则下降至碱性条件下的1 1 0 ，2 ，3 丁二 醇产量上升3 7 倍【2 6 1 。有研究结果表明，以木糖作为底物时，最佳p h 为5 2 t 1 引， 6 上i|； 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 以木质纤维素水解液为底物时，发酵最适p h 为6 0 6 2 ，当p h 小于4 2 时没有 生长现象2 7 1 。而以葡萄糖作为底物，生产2 ，3 丁二醇的最佳p h 是6 o 【2 引。 1 2 2 温度的影响 由于参与代谢的酶活力与温度关系密切，培养温度也决定了生物转化的效 率。总的来说，微生物生产2 ，3 丁二醇的最适温度在3 0 3 5 。c t 2 9 1 。由于2 ，3 丁二 醇的产生过程基本上与茵体生长成耦联的关系，因此最高产量的温度与最适生长 温度基本一致。b l a n c o 报道以葡萄糖作为底物时，最佳温度是3 4 。c 【3 0 】，木质纤 维原料水解液作为原料生产2 ，3 丁二醇最佳温度是3 0 。c 【2 7 1 ，蔗糖作为底物是最 佳温度是3 7 。c t 3 。 1 2 3 溶氧对于发酵的影响 溶氧量是影响发酵的重要因素。常利用氧传递速率( o x y g e nt r a n s f e rr a t e ， o t r ) 作为表示溶氧状态的参数。o t r 较高时，细胞生长旺盛，糖类经过t c a 循环形成c 0 2 和h 2 0 ，限制通氧时，乙酸产量增加。继续限制溶氧含量，2 ，3 丁 二醇、乙偶姻、乳酸生成量增加。在极低溶氧条件下，2 ，3 丁二醇和乙醇生成量 相当。在较低的溶氧条件下，乙偶姻可以被n a d h 还原为2 ，3 丁二醇从而使2 ，3 丁二醇成为主要的产物( 见下图所示) 利用1 0 0g l 的木糖作为发酵原料，氧 气传递速率为0 0 2 7m o l l h a ，2 ，3 t - 醇的平均生产效率为1 3 5g l h 1 1 3 】。 r e l 删a n do x y 删姗t t a t 畸t n y 1 o 图1 5 通氧量对于b p o l y m y x a 产物成分的影响 f i g1 5t h ee f f e c to f r e l a t i v eo x y g e na v a i l a b i l i t yo nf r a c t i o n a lp r o d u c ty i e l d si nb p o l y m y x a o t r 是控制2 ，3 丁二醇产率的有效参数，降低o t r 将会有效增加2 ，3 丁二 i，葛重。妻k 浙江大学硕士学位论文第一章文猷综述 醇的转化率。但由于细胞浓度的下降，使得总浓度下降，因此产量最高和产率最 大时的o t r 并不相同。b e r o n i o 和t s a o 研究了o t r 在单批发酵中对于2 ，3 丁二 醇生成的影响。菌体生长可以分成两个阶段：能量偶联生长( e n e r g y c o u p l e d g r o w t h ) 和非能量偶联生长( e n e r g y u n c o u p l e dg r o w t h ) 。他们发现，在能量偶联阶 段，控制合适的溶氧条件可以获得最较为理想的2 ，3 丁二醇产量【3 引。 在利用b s u b t i l i s 作为发酵菌株时，m o e s 等发现，搅拌速度决定溶氧量，溶 氧量决定不同产物的比例：“ - 3 溶解氧( d i s s o l v e do x y g e n ，d o ) 大于1 0 0p p b ( p a n s p e rb i l l i o n ) 时，主要产物是乙偶姻，小于1 0 0 p p b 时，主要产物是2 ，3 丁二醇。 在8 0 9 0p p b 之间时，两者的比例变化很大【3 3 1 。 此外，溶氧量对于2 ，3 丁二醇的光学活性也具有影响。n a k a s h i m a d a 等人利 用p a e n i b a c i l l u s p l o y m y x a 生产2 ，3 丁二醇，发现随着通氧量的提高，2 ，3 丁二醇 的光学活性会减小。这是因为n a d p h 依赖性双乙酰还原酶的表达量会随着通氧 量的增加而增加，导致s 型乙偶姻产量的增加，最终使得内消旋2 ，3 丁二醇产量 增加【3 4 1 。 1 2 4 添加因子对于发酵的影响 在2 ，3 丁二醇的发酵过程中，添加一定的微量元素有利于细胞的生长和产物 的合成在发酵的过程中添加酵母膏、玉米浆、麦芽浸膏，不但可以3 1 、充氨源， 也可以提供一些营养因子。值得注意的是，2 ，3 丁二醇的合成基本上是和菌体生 长藕联的，但菌体过度生长会消耗大量的糖类，从而降低2 ，3 丁二醇的产量。有 报道称有些金属离子可以提高2 ，3 丁二醇的产量【”1 。证明f e 2 + 和m n 2 + 在分别添 加和共同添加时都能提高2 ，3 丁二醇的产量，进一步的实验表明可能是无机盐中 的i 0 4 孓的提高才是产量上升的原因。 1 3 纤维素原料的生物利用 1 3 。l 纤维素酶的生产 自然界中，许多细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶3 6 1 。目前应用于纤 维素酶生产的真菌主要有曲霉属( a s p e r i g i l l u s ) 、木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、根霉 属( r h i z o p u s ) 、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、镰孢菌属( f u s a r i u m ) 和漆斑霉属 ( m y r o t h e c i u m ) 。细菌中可以生产纤维素的包括芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 和纤维 r 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 素粘菌属( c e l l o c o c c u s ) 等；放线菌有链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 和嗜热单孢菌 属( t h e r m o m o n o s p o r a ) 等。在众多微生物中，木霉属( t r i c h o d e r m a ) 的真菌是 研究最多的纤维素酶生产菌属，特别是木霉属中的里氏木霉( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) 。从2 0 世纪6 0 年代末开始，科技工作者野生型菌株出发，开展了诱变 育种工作，取得成果并获得了很多优良的突变菌株，其中m c g 7 7 、r u tc 3 0 、 q m 9 4 1 4 三个菌株是目前研究最多以及应用较广的三个里氏木霉菌株 3 7 - 4 0 】。随着 分子生物学的飞速发展，近年来已经出现了大量关于纤维素酶基因克隆与表达的 研究报道，其思路主要是通过基因工程途径构建高纤维素酶生产工程菌【4 1 4 2 1 。 纤维素酶的生产是生物转化木质纤维原料的最重要的成本环节，因此对于生物质 的转化具有非常重要的意义。一般来说，纤维素酶发酵工艺包括液体深层发酵和 固体发酵两