chk1反义寡核苷酸增加hela细胞顺铂作用下凋亡敏感性(1)

chk1chk1 反义寡核苷酸增加反义寡核苷酸增加 HeLaHeLa 细胞顺铂细胞顺铂 作用下凋亡敏感性作用下凋亡敏感性(1)(1) 这篇chk1 反义寡核苷酸增加 HeLa 细胞顺铂作用下凋亡敏 感性论文是程序自动抓取于互联网上，查看更多请点击： 论文频道：lwxz/ 作者：朱克修，王佳， 李玢，曹亚莉，韩晓兵 【摘要】 目的：通过反义封闭 chk1 基因，阻断 细胞周期检测点信号传导通路，从而增加宫颈癌 HeLa 细胞 对顺铂的敏感性.方法：采用 MTT 法检测梯度浓度 DDP 作用 人宫颈癌细胞株 HeLa24,48 和 72h 后对细胞的生长抑制率. 以脂质体为载体将 chk1 正义链和反义链转染 HeLa 细胞， 用 WesternBlot 测量 Chk1 蛋白的表达，用流式细胞仪和 TUNEL 法检测 DDP 作用后细胞凋亡率.结果：DDP 对 HeLa 细 胞有生长抑制作用，并有时间和浓度依赖性.反义封闭 chk1 基因可抑制 Chk1 蛋白表达（P） ，DDP 作用下细胞凋亡率为%, 高于转染正义链的%（P）.结论：反义封闭 chk1 基因可增 加 HeLa 细胞对 DDP 的凋亡敏感性. 【关键词】 Chk1 基因；反义核酸技术；宫颈肿瘤；顺铂 【Abstract】 AIM:Toinvestigatetheeffectofchk1genein cisplatinresistanceofcervicalcancertoblockthesign altransductionpathwaysofcellcyclecheckpoint,bytarge tingchk1geneusingantisenseoligonucleotide,soastoenh ancethedrugsensitivityofcervicalcancerHeLacellstoDD P.METHODS:TheproliferationinhibitionratesofHeLacell sbyDDPindifferentconcentrationsweremeasuredbyMTTass ay.OligonucleotidewastransfectedintoHeLaexpressiono fChk1 wasobservedbyWesternBlot.TheapoptosisrateofHe LacellsinducedbyDDPwasinvestigatedbyflowcytometryan dTUNEL.RESULTS:ThegrowthinhibitionrateofHeLacellsin creasedgraduallyinatimeandconcentrationdependentman ner.Transfectionwithantisenseoligonuleotidetargetin gchk1inhibitedtheexpressionofChk1protein,andtheapop tosisratewassignificantlyhigherthanthatofthesensebl ocking. CONCLUSION:Antisenseblockingofchk1increases theapoptosissensitivityofHeLacellstoDDP. 【Keywords】 chk1gene；antisensenucleicacidtechnology;cervixneop lasms;DDP 0 引言 宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤.近年来以顺 铂（cisplatin，DDP）为核心的联合化疗在宫颈癌治疗中 取得了一定进展.有研究认为，细胞周期检测点途径主要由 ATM，ATRChk1/2Cdc25A，Cdc25B，Cdc25C 轴组成1 ， 细胞周期检测点激酶 1 属于丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周 期检测中最关键的效应蛋白激酶2.以 chk1 为作用靶点,干 扰细胞损伤修复机制,提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种 有效的治疗选择.我们以 chk1 反义寡核苷酸链转染 HeLa 细 胞，观察其化疗后的凋亡敏感性. 1 材料和方法 11 材料 人宫颈癌 HeLa 细胞株由西安交通大学医学院第一附属 医院临床研究医学分子中心提供.在 37,50mL/L 的 CO2 条 件下用含 100mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 培养基培养. RPMI1640 购自 Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物 工程材料有限公司；MTT 购自 Amressco 公司；转染试剂 LipofectamineTMXX 购自美国 Invitrogen 公司；鼠抗人 Chk1mAb 购自 Neomarkers 公司；辣根酶标记的羊抗鼠抗体 购自博士德公司；ECL 购自 AmershamBioscience 公司； AnnexinVFITC 试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司； 原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物公司. 12 方法 实验分 4 组：正常对照组，细胞未经任何处理；空脂 质体组；转染 chk1 正义寡核苷酸链组；转染 chk1 反义寡 核苷酸链组.BD 组转染后用 20mol/LDDP 处理 24h. 121 MTT 法检测 DDP 对细胞的生长抑制率取对数生长期的 HeLa 细胞， 调整细胞密度 5107/L，接种于 96 孔板,200L/孔,培养 24h 后 DDP 终浓度为 10,20,40,80 和 160mol/L,每个浓度 设 4 个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照（无细胞） ， 分别于作用 24,48 和 72h 后加入 5g/L 的 MTT 溶液，20L/ 孔，继续培养 4h 后，吸去上清，加入二甲基亚砜， 150L/孔，振荡器震荡 10min，使结晶溶解完全，用酶标 仪在 490nm 波长处测量 A 值，计算细胞增殖抑制率（%）. 绘制 DDP 对 HeLa 细胞的生长抑制曲线. 122 转染效率的检测 chk1 反义寡核苷酸序列根据参考文献3-4的方法， 由上海生工生物技术服务有限公司合成，序列为：chk1 反 义链：5GGCACTGCCATGACTCCA3;正义链： 5TGGAGTCATGGCAGTGCC3,采用全硫代修饰，部分寡 核苷酸链的 5端以 FITC 标记.严格按照 LipofectamineTMXX 试剂说明书进行转染，于转染前 1d 用 无抗生素的含 100mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 调整细胞密度 为108/L，接种于 24 孔板，500L/孔.转染当天换为 500L 无抗生素无血清 RPMI1640.分别取不同量的荧光标 记的寡核苷酸链加到 50L 的 RPMI1640 中，混匀.再取 LipofectamineTMXX2L，加到 50L 的 RPMI1640 中混匀. 室温放置 5min 后，将分别混有寡核苷酸链和 LipofectamineTMXX 的 RPMI1640 混合，室温放置 20min（寡核苷酸链与脂质体比值分别为 g2L；g2L 和 g2L）.将上述混合物加入 24 孔板中，轻轻混匀，培养 6h 后,将培养基换为 500L 含 100mL/L 胎牛血清的 RPMI1640，继续培养至 24h，荧光 倒置显微镜下观察转染效率. 123 WesternBlot 法检测 Chk1 蛋白表达裂解提取 HeLa 细胞总蛋白，按 Bradford 法进行蛋白定量，煮沸 5min 使蛋白变性，120g/L 的 SDSPAGE 电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜 置于 50g/L 脱脂奶粉中室温封闭 1h，以鼠抗人的 Chk1mAb 按 1400 室温孵育 h，用 TBST 洗膜 6 次，每次 3min，再 与辣根酶标记的羊抗鼠二抗 1500 室温孵育 1h，TBST 洗 膜 6 次，每次 3min,以 ECL 显色,X 光胶片暴光，洗片.用凝 胶成像系统检测蛋白表达灰度值. 124 细胞凋亡的检测 收集细胞，调整细胞浓度为 1108/L,取细胞 1mL，PBS 洗涤后将细胞悬于 BindingBuffer200L，加 AnnexinVFITC10L，混匀，室温避光孵育 15min，再加 入 BindingBuffer300L 和 PI5L，流式细胞仪检测细胞 凋亡.另将 HeLa 单细胞悬液接种于 24 孔培养板培养，使细 胞爬于盖玻片，按上述各组方法处理细胞后捞出盖玻片， 40g/L 多聚甲醛固定，按 TUNEL 试剂盒说明进行操作. 统计学处理：重复 3 次实验，实验结果采用 SPSS 统计 软件进行方差分析及两两比较，P为差异具有统计学意义. 2 结果 21 DDP 对 HeLa 细胞的生长抑制作用结果显示，A 组 HeLa 细胞体外生长良好，10mol/LDDP 作用 HeLa 细胞 24h 后抑制效应不明显，20，40，80 和 160mol/LDDP 对 HeLa 细胞有抑制效应，且随着时间的延长和浓度的增加， 其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖性特点（图 1）. 由于 20mol/LDDP 作用 24h 后对细胞已有明显的抑制作用， 因此后面的实验中选用 20mol/L 为药物处理浓度. 22 寡核苷酸转染效率用 FITC 标记的寡核苷酸转染 HeLa 细胞，24h 后用荧光倒置显微镜观察转染效率，发现 DNA/LipofectamineTMXX 脂质体比率为 g2L；g2L 和 g2L 时的转染效率分别为% ，%，%，其中 DNA/LipofectamineTMXX 脂质体比率为 g2L 时转染效率最高. 23 HeLa 细胞 Chk1 蛋白的表达转染 chk1 反义寡核 苷酸可明显抑制 Chk1 蛋白的表达（图 2） ，与 A 组，B 组和 C 组比较差异具有统计学意义（P）. 24 chk1 反义寡核苷酸对顺铂作用下 HeLa 细胞凋亡 的影响转染 chk1 反义寡核苷酸后 DD