组织培养基本知识问答

组织培养基本知识问答组织培养基本知识问答 1.有些植物在组培生根阶段会把大量元素和糖减半，我应根据什么来判断是否需要减半？ 答：在组培过程中，我们提起配方往往只局限于激素的配比和添加物的使用，其实对基本 培养基的构成和培养条件（温度、光照、湿度、PH 等）都属于配方的范畴。在这方面的 调整主要是根据实际培养状况灵活调整。在生根阶段，试验证明培养基高渗透势或液体培 养基有利于营养素和激素的运转，有利于根的发生和形成质量，因此大部分植物在生根过 程需要调整基本培养基的组成。但具体需不需要应该通过对比试验确定。 2.什么是滤纸桥生根？ 答：1）滤纸桥生根技术是分化苗直接瓶外生根技术，其作用主要是简化生根环节，提高 炼苗成活率，降低组培成本，同时还可以对污染苗进行最大程度的利用。 3.组织培养中出现黄化的原因有几种？ 答：黄化是指在组培过程中由于培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的 幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳。这一现象在植物组织培养中比较常见，特别 在部分木本花卉中较为常见，引起黄化的主要原因是培养基中 Fe 的含量不足；各矿质营 养不均衡；培养环境通气不良，瓶内乙烯含量升高；激素配比不当；糖用量不足或长时间 不转移糖已耗尽；PH 值变化过大；培养温度不适；光照不足等。 解决的方法是，首先在配制母液和培养基的制作过程中，要检查仪器设备是否准确，还要 认真细致地核对每项称量的每一个环节；及时转接培养物；使用透气的封口膜以改善瓶内 通气状况；适当调节 pH 值、激素配比和无机盐浓度；配制培养基时切记不要忘记加糖； 控制培养室内的温度；适当增加光照；另外，在培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链 霉素、头孢霉素等，有时也会出现幼苗黄化现象，应适当减少用量或停止使用。 4.人工种芽的形成标致是什么，怎样才能算是一个完整的人工种芽？ 答：一个完整的人工种子是由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分组成。 它的优势在于：1、培养条件可以人为控制，省地省工，可直接播种。2、人工种子制作时， 可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等。3、以用于生产人工种子的体细 胞胚，可以利用生物反应器大规模生产，效率极高。4、一些珍贵种苗或树种可以通过人 工种子，加速其生产应用。 存在问题：1、并非所有植物都能培育出大量高质量的体细胞胚。2、目前的人工胚乳和种 皮还不够理想，不能有效防止微生物的腐蚀。3、人工种子的贮藏问题有待于进一步完善。 5.在组培中胚状体在外部形态上是如何与愈伤组织区别的？ 答：大量实验证实，植物体细胞具有成胚的潜力，由体细胞形成的胚状体叫体细胞胚 （somatic embryo）。一般情况，体细胞组织形成愈伤组织之后 3 周内，在愈伤组织上 出现大量胚，这些胚是由愈伤组织外层细胞以及深部细胞起源的。 在离体或活体条件下，体细胞经原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期等阶段 形成的胚叫体细胞胚状体。从外植体或愈伤组织表面产生胚状体的情况较为常见。 从愈伤组织向球形胚过渡的标志是细胞的活跃分裂形成一团致密的没有表皮层的细胞团结 构，可以明显地与疏松的愈伤组织区分开。 鉴别胚状体的标准：（1）胚状体具有极性，也就是说胚状体在发育的早期阶段，在其相 反的两端分化，分别出现茎端和根端，是一种单极性结构。（2）在组织学上，胚状体的 维管组织与母体植物或外植体的维管组织一般没有联系，其维管组织的分布呈“Y”字形。 而根或芽的分化，里面长出原形成层束，与愈伤组织形成的或外植体中的维管组织往往相 连。 6.光照强度多少 lx 是怎么计算的？ 答：1）光照强度光通量/单位面积。至于 Lux 的换算对很多人来说也是比较抽象。现推 荐一种简单的换算方法。 光是一种辐射能，故各种光源所发出的光能都有一定的强度。这种光能的强度，就叫作“光 强度”。它一般以烛光为计算单位。即以点然一种特制的鲸油蜡烛，依它沿水平方向的发光 强度作为基数1 烛光。现在所用的以电源发光的光源，其光强度的计算单位仍以烛光 为标准，称作国际烛光。在习惯上我们称瓦特。瓦特的电灯，其光强度等于国际 烛光。 2）光照强度的换算实际上要用英尺烛光，但是我还没有找到英尺烛光和日光灯之间的关 系公式。 英尺烛光是距光源一米处每平方英尺的光照强度，可以说它是这样规定的：就是一个标准 烛光（我不知道这样说对不对）在一米处一平方英尺的垂直面积上的光照强度是一英尺烛 光。 计算式：1 标准烛光10.76Lux 3）因为光照强度和发光强度的单位换算中有都有“标准烛光”这一关系，为此，我认为完 全可以用发光强度来推测光照强度的相关性。又因为同一标准的烛光，其在相同距离的光 照强度应该也是一样的，而且日光灯的瓦数和国际烛光的发光强度是相同的，所以，英尺 烛光也可以和日光灯的光照强度相同，也就是说等于日光灯的瓦数。例如 130 瓦的日光灯， 在一米处的光张强度为 3010.76322.8Lux 但在组培生产中，需要知道的是 30cm 之内的光强。这个要换算起来就只好另辟蹊径喽 就是用照度计。 7.如果在配制母液时，将 micro 和 marco 素参在同一个罐子内，会对植物有影响吗？ 答：母液配制，主要是考虑到母液稳定性问题，根据化学反应原理，浓度很高的大量素中 的阴离子，对微量素的金属离子来说是过量的，因此若混在一起，微量素中的金属离子会 很容易发生水解反应，生成沉淀，从而失效。长时间使用这样的母液，就会发生生理病害， 比如缺素症（黄叶，叶不展，萎缩变脆等）。 8.组培苗生长环境有何特点？如何针对这些特点提高移栽成活率？ 答：组培炼苗是组培过程较为重要的一个环节，是一个较为复杂的技术体系，提高炼苗成 活率是决定组培成败和降低组培成本的关键。试管苗一般在高湿（100%）、弱光 （3000-4000Lux）、恒温（25）下培养，生长的植株有以下几个特点： 1、叶片无保护组织（角质层、蜡质、表皮毛等），加之细胞间隙大，气孔开张大，因此 水分散失较快，易于萎蔫。 2、根无根毛或极少，并且有些从愈伤组织上发育的根与芽的疏导组织不相同，因此吸水 能力较弱。 而当炼苗移栽时，环境有了极大的改变：湿度降低、光照增强、温度升高、温差变大。具 以上特点的组培苗，在此环境下，叶片失水较严重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸 腾水量，从而造成植物萎蔫，炼苗失败。另一种情况是，空气温度上升要比基质温度上升 快，而根系的吸水能力在一定范围内与温度是成正比的，当气温升高时，加之湿度较低， 叶片蒸腾急速增加，此时基质温度上不去，根系吸水能力不够，造成蒸腾大于吸水的失衡 状态，从而萎蔫死亡。 要想获得高的炼苗成活率就得针对以上问题，一方面提高出瓶苗的质量，提高其抗逆性， 生根前的壮苗、理想的生根配方和生根培养环境的调控是关键；另一方面就得有针对组培 苗特点创造一个适宜的炼苗环境，比如保证空气湿度，平衡空气和基质的温度平衡关系等。 9.两次培养基用的配方都一样，为什么一个凝固的特好，一个就凝固不了？还有在诱导愈 伤时应注意什么事项？ 答：培养基的凝固无外有下列几种情况： 1、琼脂批次有变，没有做批次试验，沿用以前的用量造成不足。 2、大量素重复加入，或大量素母液配制出错。 3、PH 调的过低，或有活性炭高压灭菌时间过长，造成蔗糖分解量剧增，影响培养基的 PH 降低较多。 4、加入新的天然附加物，或附加物过多。 另外，诱导愈伤过程，除了注意激素的搭配应用外，还应该注意培养物与琼脂要紧密接触， 根据培养情况及时调整激素配比，要及时转接，考虑光暗交替培养等。 10.植物组织培养的培养基为什么只用蔗糖而不用葡萄糖？为什么动物培养的培养液中用 葡萄糖而不用蔗糖？ 答：这个问题我觉得应该从植物与动物的生理机制去思考。植物与动物的最大差别就是植 物是自养型的（光合作用）而动物是异养型的（外部吸收代谢）。植物光合产物是多糖 （二碳糖以上，包括蔗糖），贮藏产物形式是淀粉，而淀粉的合成前体就是蔗糖。蔗糖 葡萄糖果糖，所以蔗糖的合成必须同时要有葡萄糖和果糖，其实植物也只能吸收葡萄糖 和果糖。在组织培养中加入蔗糖，经熬煮和高压灭菌后就会分解成植物能够吸收的葡萄糖 和果糖形式。其实这样看来在组培中，植物也有部分异养的特点，如果在培养基中缺少任 何一种糖的形式，植物在自养能力（光合，呼吸，产物代谢等）较差的情况下，就难免会 影响其生理代谢。 与植物不同的，动物是异养型的他不需要淀粉的积累，也没光合作用，动物细胞本身所处 的生理环境和代谢方式就决定了它对糖形式的要求了。 11.请问植物病毒检测的简便方法？ 答：由于经过脱毒处理，即使未完成脱除病毒的植株，其体内病毒的含量也会较低，常常 在最初的一二次病毒检测中呈阴性，因此有人建议在前 18 个月内，必须对植株进行若干 次检测。 目前常用的植物病害检测方法有可见症状鉴定、寄生鉴别、抗血清检测、电镜检测、分子 检测等。可见症状鉴定法较简单，但准确性差，对于不表现可见症状的隐症病毒几乎无效； 而电镜检测、分子检测虽然检测准确率高，但设备昂贵，尤其电镜不可能每个组培室都配 备，故未在生产上广泛运用；目前生产上，国内外仍主要采用鉴别寄主的抗血清检测法检 测植物病毒。 12.一般情况下 KT 的母液应该配成多大浓度?IAA 能高压灭菌吗？高压灭菌成分会变吗？ 答：KT 一般配成 0.050.1ppm。 IAA 极不耐高压灭菌，一般采用过滤灭菌。如果利用高压灭菌其分解率会在 85%以上， 致使其作用不明显。 13.如何利用组培技术培养一棵未知植物？ 答：作为未知植物的组培，我想应该归为珍稀植物材料的范畴。一是数量有限，二是不曾 命名，三是无文献可查。这种材料如果性状优良，进行组培快繁是相当必要的。 一般可以通过以下步骤开展工作：1、观察植物的生物学性状，进行植物归类和属种划分。 2、确定植物的繁殖方式（分蘖、种子、扦插、根茎等），比较组培繁殖的优势。3、根据 植物特性（顶端优势，萌蘖能力等）确定组培发生方式。4、小量无菌外植体系的建立， 确定高效外植体获得方法。5、大量外植体群体建立，诱导分化配方设计。6、确定最好分 化继代配方。6、继代扩繁。7、生根配方设计与确定。8、试管苗出瓶。9、大田栽植，观 察组培苗生物学性状，与母本比较鉴别，确定优良性状的遗传稳定性。10、工厂化繁殖， 市场化运作。 14.做无毒苗的快繁,一直找不到合适的培养基,能不能帮我推荐一种? 答:关于组培快繁的方式概括起来有下边三种途径： 1、外植体愈伤组织再生芽继代生根出苗 2、外植体丛生芽继代生根出苗 3、外植体生长量切断继代生根出苗 至于采取那种途径，需要彻底了解所组培植物的生物学习性，包括繁殖方式，顶端优势， 萌孽生根能力等等。 15.初代培养时,外植体出现发白,慢慢枯死,是什么原因的? 答:外植体的初代培养出现这种情况，是比较好理解的。大田植物材料离体以后，进入不同 环境中继续生存代谢，需要一个过渡。首先，植物材料要吸收培养基的养分，不再是根吸 收，盐类浓度相对于离体的植物材料的吸收能力可能是过量的，植物材料退色就是叶绿素 形成受阻和细胞代谢受阻，另外还有培养基养分供应的有效性滞后，另外还有植物材料本 身内含物向培养基的流失等等。建议在初代培养阶段最好先采用空白培养。 16.75%的酒精和 70%的酒精有什么区别，组培时用那种好? 答:酒精的 70%和 75%都是可以的，但往往由于桶装酒精的浓度达不到 95%，这样按照 70%的配制就达不到要求了，因此我们一般是桶装按照 75%的配，瓶装则用 70%的配。 17.大型灭菌器在灭菌的时候总会出现个别瓶子破裂的现象，请教是什么原因？是温度过 高，压力过大，还是内部冷热不均造成的呢？ 答:高压灭菌造成玻璃瓶的破裂，特别是大型灭菌装置，我想最主要还是在放气冷却时造成 的。究其原因，应该是在放气时，由于容积较大，压力在不同位置（内外部）的变化速度 并不相同，致使瓶内与瓶外的压力差距较大，如果是封口膜，表现的可能就是塑料膜的破 裂。 18.做培养基时可以用自来水吗。稀释药剂可以用吗。可以用砂糖吗。我看不懂培养基用 量表。谢谢解答。主要是换算。如 ms 培养基硝酸钾用量 1650mg，碘化钾 0.025mg， 甘胺酸 0.0001mg。1mg，1l，1g 到底是多少。我个人想自己做 ms。没有分析天平。 怎么办。 答:在实际生产中，自来水经过简单处理就可以作为组培用水。但若配药就需要用蒸馏水或 纯净水。大量元素母液的配制可以根据实际需要进行选择倍数，比如硝酸钾用量 1650mg/L，如配成 20 倍，就需称 1.650*20=33g，以此类推，按照正确顺序溶解定 溶到 1L 即可，配培养基时量取的体积就是 1000/20=50ml，依次推算即可。 另外，如果您的配药条件不是很好，我建议可以应用干粉培养基，这样可以节省很多投资 和时间。 19.水解酪蛋白有酸水解，有酶水解，在使用过程中有没有区别，他们的在培养基中的作 用是一样的吗？ 答:水解酪蛋白（CH)和水解乳蛋白（LH)是多种氨基酸的混合物，对胚状体、不定芽的分 化有良好的促进作用，通常用量在 500mg/L，特别是当有高水平 IAA 存在时更是如此。 对于酪蛋白不管是酸解还是酶解，作用都是一样的，但考虑到组培苗的异养功能，酸解应 该更有利于发挥其作用。 20.在初代培养阶段,成功地诱导出绿色的愈伤组织.进行继代培养时,愈伤组织块增殖很快, 但始终没有芽出现.请问:怎样解决不产生不定芽的问题? 答:愈伤组织诱导成功后，如何有效地诱导出不定芽是相当重要的。外植体产生愈伤组织到 的时间和愈伤生长的程度，随不同植物种类和培养条件有较大的差异。有些植物形成不定 芽比较容易，能够直接从外植体受伤的或没有受伤的部位分化出不定芽。 一般认为细胞分裂素/生长素的比值是控制器官发生的重要因素，调整他们的适当比值就可 以有效的控制愈伤组织的芽、根等器官的分化。在此理论下，愈伤组织诱导不定芽的能力， 与愈伤组织的状态密切相关，能够诱导形成分生细胞团至关重要，分生细胞排列较为规律， 较大的在外，越向内细胞越小，排列也越紧密，细胞质浓厚，核相对较大，这样的分生细 胞在激素比值调控的情况下，就很容易形成不定芽。这也就是为什么在愈伤继代的时候要 交替使用不同激素的原因。 大量繁殖愈伤组织接着再生苗似乎是个理想的方法，但重复的继代培养使许多愈伤组织再 生苗的能力渐弱甚至丧失，同时愈伤组织再生苗变异率的增加，使得这种方法在生产中只 能用于少数植物。 总之，对于这个问题除了化学调控的因素还有物理方面的原因，还有很多问题限于篇幅不 再赘述。 21.NAA 和 2，4-D 哪个生长素促进愈伤诱导效果好一点？ 答:对于愈伤诱导和增殖来说，2，4D 效果要比 NAA 明显，但有一个问题，很多情况下， 2，4D 诱导的愈伤比较难以再生芽。 22.灭完菌，凝固好的培养基，上面总有一层水请教老师之所以这样，是因为配置培养 基时哪里*作不当了吗？如果将植物材料转接于这样的培养基中，会导致整瓶苗玻璃化吗？ 或者出现其他怎样的后果呢？ 答:培养基灭过菌后或多或少会有积水现象，一般来说冬天要轻一些。如果积水太多接种的 时候倒出来，不然容易造成容器壁水珠比较多，影响光照，从而造成玻璃化现象加重。 23.洋葱加在培养基中，除了杀菌还有别的什么作用？ 答:洋葱加在培养基，作用除了抑菌之外，其含有的丰富化学成分，与其他有机附加物的作 用是差不多的。在种子发芽试验中加入激素，造成变异的几率很低，可以不予考虑。 24.有些树种受伤后会分泌出一些白色的浆液，比如梓叶槭，不管是茎段还是叶片，只要 有伤口的地方都会有浆液，而这会加重外植体的褐化，请问应该怎么处理呢？ 答:这是植物的伤流现象。由于伤流液中含有酚类物质，因此在培养中极易引起褐变。许多 研究表明，选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要手段。通常外植体应有较强 的分生能力，在最适宜的细胞脱分化和再分化培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态， 便可大大减轻褐变。适宜的温度和在全黑暗条件下进行培养也可显著减小外植体的褐变。 液体培养和连续转接也是很好的措施。另外，加入一些氧化剂或用抗氧化剂进行材料（外 植体）的预处理或预培养，可大大减轻醌类物质的毒害。这些抗氧化剂包括：VC、柠檬酸、 硫代硫酸钠（Na2S2O3）等。此外，0.1-0.5活性炭对吸附酚类氧化物的效果也很明 显。 25.在组培中，叶片较易脱落，会是什么原因引起的呢？ 答:叶片脱落是对逆境的一种表现，温度过高，透气不良，培养物过于密集，久不转移，有 害气体积累（乙烯、氨气、甲醛）等会引起植物材料的落叶或黄化。 26.空白培养是什么意思？ 答:空白培养在高效外植体系的建立方面是很有用的步骤，空白培养就是不加任何激素的培 养过程。对于外植体迅速适应瓶内环境和有效外植体群体的建立是很有用的。 27.如果芽体只是长高,不膨大也不分化,有的静止不动,请问这会是什么原因引起的呢? 答:成活外植体如何成功启动是组培过程中至关重要的环节之一。由于大田植物材料其激素 水平和细胞活性差距较大，如何迅速将外植体对培养基条件做出反应也有很多方法，首先 芽体萌发时应用赤霉素，黑暗培养，高低激素配合使用等都会起到很好的效果。 28.在一些资料上,经常看到 meq/l,意为溶液的总离子浓度.但我还是不理解.究竟是以离子 计,还是以电荷计? 比如 0.1M/L 的硫酸镁溶液,用 meq/l 表示,应该是 100meq/l,还是 400meq/l?与离子所带的电荷有无关系? 答:毫克当量(mEq)表示某物质和 1mg 氢的化学活性或化合力相当的量.1mg 氢,23mg 钠,39mg 钾,20mg 钙和 35mg 氯都是 1mEq.其换算公式如下： mEq/L(mg/L)原子价/化学结构式量 mg/L(mEq/L)化学结构式量/原子价 um/L=(mEq/L)/原子价 (注：化学结构式量原子量或分子量) 由此来看 0.1M/LMgSO4=(mg/L)原子价/化学结构式量 0.110004120/120 =400meq/L 如果是水质检测，对于金属离子（杂质）Mg2来说就是 200meq/L 了，不知对否？ 29.用幼芽启动用于分化芽的愈伤,NAA 与 6-BA 的比例有一般规律吗?还有用 2,4-D 启动 的愈伤再转到只含 NAA 和 BA 的培养基中,愈伤变为绿色,有分化的可能吗? 答:离体的愈伤组织是一种正在增生的非组织化的细胞群，可以从几乎任何类型的植株获得。 由外植体形成愈伤组织很少是自发的，它代表创伤反应的扩展，一般要求在培养基中有生 长素，常常还要求有细胞分裂素同时存在。最有效地产生愈伤组织的激素浓度随所用的植 物及器官而异，但其倾向是比外植体直接诱导苗所需的浓度要高。 大多数植物中愈伤组织可从外植体上分离开，并可进行继代培养和连续繁殖，所使用的培 养基中所含的激素水平，与用于诱导愈伤组织时相同。如果降低激素水平，或适当调节生 长素对细胞分裂素的比例，某些愈伤组织将再生出苗或胚。 30.洋葱也能加在培养基中?能说说它的机理吗? 答:培养基中添加有机附加物，如马铃薯、香蕉、椰汁等，主要是由于他们含有丰富的糖、 蛋白质、各种无机盐、维生素以及各种活性物质。洋葱也不例外，除了含有丰富的营养物 质之外，洋葱还含有丰富的硫化合物，是强有力的抗菌成分，能杀死多种细菌。可以说很 多参考资料中提到洋葱在组培中的应用是不无道理的。 31.在壮苗生根培养基中培养，会有黄叶出现，看起来感觉苗很不好，叶子都枯的。是什 么原因引起的? 答:组培苗的黄化是由培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的。但这样的 解释是比较抽象的。我觉得在壮苗生根阶段，由于培养基的变化，特别是激素的改变导致 培养基高压灭菌后 PH 变化与分化阶段是有较大差别的，加之苗子与培养基接触面积的变 小，营养供应滞后。所以很多时候就是当根发出后，会有不同程度的改变。如果解决的话， 还应该确定一下生根培养基高压灭菌后的 PH 变化，进行适当调整，同时在分化时进行适 当壮苗调整也是比较好的方法。 32.请问：（）接种前，接种工具要浸泡在酒精中，所使用的酒精浓度该是多少，是 75%还 是 95%？（）我用新铁炮百合鳞片作外植体，对鳞片切割有没讲究什么方法，可以减 少污染，书上讲根据极性方向接种到培养基上，怎么判断极性呢？（）使用玻璃瓶不 诱钢的盖子作为培养容器，透气性是不是不好，会影响培养效果吗？ 答:接种工具接种灼烧前浸泡酒精的浓度，可以是 75%也可以是 95%的。至于极性指的 就是植物材料有趋向发育的特征。比如是茎繁，靠近茎顶端发出芽子，远离顶端会长出根。 是根繁的话，新芽发生于近心端，新根发生于远心端。因此在接种时，尽量不要使材料倒 置，尽量保持植物的极性