糖组学综述 王志来

糖组学王志来 1、糖组及其复杂性与糖组学 1.1 糖组及其复杂性 根据基因组和蛋白质组的定义，糖组应该被定义为单一生物体 中的整套聚糖系统。但是相比而言，糖组比基因组和蛋白质组复杂 很多。倘若基因不发生突变，一个生物体的基因组也是不变的，而 同一个基因却可产生多种相关但是又不同的。此外，相当多的蛋白 质在表达后，又经受了一系列的后加工。相同的的基因组在不同的 外界刺激条件后，可以产生不同的蛋白质组，做出相应的应答。因 此，一个基因组对应的不是一个蛋白质组1。蛋白质糖类可以认 为是基因信息传递的延续。在蛋白质的肽链上，可以挂上糖链，成 为糖蛋白，使蛋白质具有更多的特性和功能。同样结构的聚糖又可 接到不同的载体上，形成不同的糖复合物：糖蛋白、蛋白聚糖和糖 脂等。不同情况下，糖复合物的糖链结构则变化更多。在所有生物 体中，基因是由 4 种核苷酸构成的，因此，所有生物的基因组可以 用同样的方式表述。在不同生物体的蛋白质组，已是各不相同的， 所幸的是，它们的结构还可以从基因组推断。而不同生物体中的糖 组，则无法统一，更无法由基因组推测。例如，植物和微生物有细 胞壁，而动物没有。植物和微生物的细胞壁分别由不同的糖类构成。 细菌都有肽聚糖，但是，革兰氏阴性菌还有脂多糖，而革兰氏阳性 菌则没有脂多糖。不同的真菌又因为表面的多糖组成的不同，而归 属于不同的种属。植物合成各种各样的多糖，此外，它们的次生代 谢产物中有许多是糖苷，它们的“糖组”更是纷繁复杂。基于以上 两个原因，希望包罗万象地用一个“糖组”包括单一生物体中的整 套聚糖，几乎是不可能的。所以，糖组的复杂性是不言而喻的。与 此同时，和基因组不一样，不同生物糖组的可比性也极小。因此， 对糖组的研究最合适的做法是将糖组分解为不同的小组，例如对高 等动物的糖组可分为糖蛋白组、蛋白聚糖组和糖脂组。而且，与细 菌和植物相比而言，高等动物的糖组还是比较简单的。平林淳和笠 井献一的研究组迄今所着眼的是糖蛋白组，而且以线虫的基因组为 基础2。 1.2 糖组学 受基因组和蛋白质组定义的影响，糖组被定义为单一生物体中 全部聚糖的总称，糖组学则是研究糖组结构与功能的科学。糖组和 糖组学是两个不同的概念，糖组是了解一个生物体在某种情况下所 具有的全部聚糖种类，而糖组学是对聚糖与蛋白质问相互作用和功 能的全面分析研究，包括糖组的结构鉴定、编码糖蛋白的基因和蛋 白质糖基化的机制和功能等。糖分子多以糖蛋白或其它结合物形式 存在于细胞的任何部位，糖与蛋白质问的相互作用能介导细胞问相 互反应的基本过程，如细胞的增值、吸附、识别和免疫等功能3。 糖组学研究是定义复杂生命系统和细胞体系必不可少的，如果在糖 组概念下，能够阐明聚糖结构的差异与个体、发育、疾病等的关联 性，就可以定义糖的功能和它们存在的目的糖组学是继基因组学 和蛋白组学后的新兴研究领域，它的研究结果直接关系到是否能够 阐明基因功能及细胞功能4这是因为：第一，所有的生命体都是 由细胞组成，而其表面都被各种形式的聚糖所包被，帮助我们识别 细胞类型和状态但与蛋白质不同，单从基因组信息无法预测最终 的聚糖结构，因此，迫切需要开发新的糖组学研究手段和思路以分 析糖组结构和功能第二，就像磷酸化一样，糖基化是所有真核蛋 白质翻译后加工的一种形式，但蛋白质糖基化远较单一结构形式的 磷酸化复杂得多，因此聚糖研究存在各种技术困难，蛋白质组学中 的大多数方法不适用糖基化研究第三，按医学观点聚糖研究非常 实用，细胞表面聚糖是生物体所必需的，可以避免各种微生物对寄 主细胞的感染 2、糖组学研究中的方法 2.1 糖捕捉法 作为新的亲和技术，糖捕捉法(glyco-catch)在糖组学研究中已被用 于糖蛋白的系统分析，通过与蛋白质组数据库结合使用，这种方法 能系统地鉴定可能的糖蛋白和糖基化位点，目前已成功用于 Caenorhabditiselegans 的糖组研究5具体策略概括如下：(1)凝 集素亲和层析一 1(用于糖蛋白分离)：凝集素柱的分离效果与要分 离糖蛋白的聚糖类型有关，因此不同组别糖蛋白的纯化步骤可以单 独或串联使用不同的凝集素柱(2)蛋白质消化：将分离得到的糖蛋 白用 Achromaobacter 菌的蛋白酶 I 消化以生成糖肽，在消化前糖蛋 白应先用 8 molL 尿素变性，然后在 4 molL 尿素存在下消化至 少 16 h，这种酶对赖氨酸有严格专一性，具有较好的裂解效率(3)凝 集素亲和层析-2(用于糖肽分离)：采用与步骤 1 相同的凝集素柱从 消化液中扑集目的糖肽(4)HPLC 纯化糖肽：上述步骤得到的糖肽 通常是混合物，应进一步用二维 HPLC 进行彻底分离纯化(5)序列 分析、质谱和解离常数测定(6)数据库搜索和聚糖结构分析以获得 相关遗传和糖基化信息然后，使用不同的凝集素柱进行第二和第 三次循环，捕集其它类型的糖肽，以对某个细胞进行较全面的糖组 学研究 2.2 糖微阵列技术 与基因组学和蛋白组学研究不同，目前还没有一种成熟的高通 量工具可用于糖组学研究最近已有科学家将微阵列技术 (microarray)引入糖组学研究，可广泛用于糖结合蛋白的糖组分析， 以对生物个体产生的全部蛋白聚糖结构进行系统鉴定与表征6糖 微阵列技术是生物芯片中的一种，是将带有氨基的各种聚糖共价连 接在包被有化学反应活性表面的玻璃芯片上，一块芯片上可排列 200 种以上的不同糖结构，几乎函盖了全部末端糖的主要类型因 为糖蛋白通常只能识别糖链中的最后几个末端糖残基，推测天然存 在的末端序列大约有 500 种左右这种技术已成功用于糖结合蛋白 (凝集素)的筛选和表征，但目前可用于微阵列的糖数量还非常有限， 从而限制了该技术的广泛应用为此，Pilobello 等用凝集素代替 聚糖固定在芯片上，建立了凝集素微阵列技术，以快速分析糖基化 蛋白质7随后，又将瞬息场荧光检测技术与凝集素微阵列相结合， 形成瞬息场荧光辅助凝集素微阵列技术，即时观察多种糖-凝集素反 应，显著提高了检测灵敏度，即使十分微弱的糖凝集素反应(解离 常数大于 10molL)也能被定量检测 H聚糖标记是影响糖微阵列构 建的一个主要因素，因为标记的同时还必须提供一个配基以便与芯 片连接，为微量聚糖的结构与功能研究和构建新的天然聚糖微阵列 提供了新的工具. 3、糖组学在肝病中的应用 肝病的发生发展是由炎症到纤维化再到实质细胞的病变，是一 个渐进的过程。早期肝纤维化具有可逆转性，因此在这一阶段的诊 断对整个疾病的进程和疗效至关重要。但目前肝纤维化早期诊断仍 是临床一大难题8。许多急性期蛋白在炎症损伤肝病死亡人数约 30 万人，其中 50为原发性肝癌。在肝病的炎症、纤维化、癌变的过 程中均有糖类物质结构和功能的改变，糖类因其结构复杂、功能多 样包含了巨大的信息量，一旦在翻译后的修饰过程中发生糖链修饰 紊乱，就会产生相当严重的后果。在病理状态下，由于聚糖代谢酶 类活力的改变或缺陷，可使糖复合物中的糖链数量和结构产生异常， 最终导致细胞功能失常，甚至出现恶性表现，糖链结构异常还可能 被机体免疫系统识别，引起细胞免疫和体液免疫应答，并激发自身 免疫反应及免疫调节功能紊乱，介导细胞毒性反应，引起肝细胞的 损伤9。所以糖复合物中糖链数量和结构变化与肝病关系密切，成 为当今糖生物学与肝病研究的结合点，受到高度关注。所以当前在 我国开展糖类与肝病的相关性研究具有重大的意义。 4、糖组学研究与肝癌的治疗研究 在许多恶性肿瘤组织中都发现有糖蛋白糖基化的异常，采用蛋 白组学的分析方法结合先进的糖蛋白荧光染色技术对正常人的肝细 胞系与人肝癌细胞系进行对比发现，两种细胞系的糖基化程度存在 明显的差异，有的糖基化水平下调，有的糖基化水平上调，表明糖 蛋白的糖基化改变可能在肝癌的发生和发展中起到一定的作用10。 HAbl8GcDl47 是由我国第四军医大学陈志南教授发现的一种肝癌 功能型新基因，该基因表达一种高度糖基化的跨膜蛋白，有调控肝 癌扩散和转移的功能，促进肝癌的发展、侵袭和转移。其过度表达 增强人类肝癌细胞的转移潜能。HAbl8GCDl47 有两种不同的类型， 它们的糖基化程度和类型是不同的。作为异质 N 一糖基化的结果， 其存在高度糖基化的形式。通过链病毒菌素(一种 N 一糖基化抑制剂)实 验说明：HAbl8GcDl47 的表达与肝癌的侵袭和转移相关，当其表 达量下降时，与上皮细胞的黏附能力也下降，说明 CDl47 的糖基化 起到关键作用。hepaCAM 是包括 416 个氨基酸片段的基因产物，具 有免疫球蛋白样细胞黏附分子的典型结构。在原发性肝癌患者标本 中 hepaCAM 表达下降，这种糖基化的蛋白质大部分聚集于细胞膜上， 当在 HepG2 重新表达的时候，hepaCAM 加速细胞的伸展和移动，减 少菌落的形成，抑制细胞的生长，表明 hepaCAM 影响细胞的黏附和 控制细胞的生长。酯类在肝内的聚集也是原发性肝癌的发病原因之 一，其机制与乙肝病毒的 X 蛋白有关，X 蛋白通过加强 N 一乙酰葡 糖胺基转移酶的表达来抑制载脂蛋白 B(ApoB)的分泌，导致异常 糖基化的 ApoB 在肝细胞内聚集口“。肿瘤的转移严重影响着肝癌患 者的预后和存活，研究发现在原发性肝癌患者血液中转化生长因 TGF- 的浓度升高，与整合素的表达成正相关，TGF- 通过刺激 -整合素的表达而促进肿瘤的转移，所以在原发性肝癌转移过程中 TGF- 起至关重要的作用，是肝癌治疗中一个潜在的新的靶目标11。 关于糖基化异常改变的研究正在不断的深入，用来更深层次的揭示 疾病的发生发展机制。基于糖组学在肝癌发生发展中的研究发现， 糖组学在肝癌诊断中的应用也引起高度重视。HBV 与原发性肝癌的 关系最为密切，但是原发性肝癌的确诊通常是在晚期，而错过了最 佳的治疗时期。而且病理组织学检查仍是目前诊断的金标准，但鉴 于组织学检查固有的缺陷如损伤性检查、不能动态检测重复进行、 存在取材差异等，寻求非损伤性检查作为肝癌早期诊断的指标成为 这一领域科学家研究的目标。 5、糖组学的研究展望 目前糖组研究方法较少，糖蛋白为主的糖组学技术问题和发展 趋势是：a糖蛋白分离的问题使用植物凝集素柱捕获不同的糖蛋 白是目前许多研究者的首选技术，但是一方面没有一种能吸附所有 类型糖蛋白的植物凝集素，另一方面可能会丢失一些能通过任何植 物凝集素柱的糖肽，而研究不被任何植物凝集素识别可能具有生物 学上的重大意义的聚糖具有更广泛的吸附范围内源植物凝集素越 来越多地用于捕获糖蛋白，而全能糖吸附剂的发展是必然趋 势b使用当前技术，糖蛋白的基因识别效率较低非常短的糖肽 (小于 6 个氨基酸)在基因组数据库中是不可能鉴定目标基因的非 常长的糖肽(大于 20 个氨基酸)即使可以成功鉴定目标基因，关于糖 基化位点的信息却有限c糖链的结构分析和共价键的确定仍然不 是一件容易的工作，虽然高精度的质谱可以完成一些鉴定，但是该 技术要求纯的样品和熟练的操作人员，且仪器昂贵d目前这些糖 组研究方法几乎是静态的，而生物体的糖基化过程是动态的，研究 方法的动态化也是一种必然糖组学是后基因组学的一个重要领 域许多生物信息都体现在丰富多样的复合糖形式，应用基因组一 蛋白质组糖组的概念来全面解释复杂的生命系统是完全必要的， 随着样品分离技术和相关仪器的发展，快速准确的糖组鉴定将能够 实现 参考文献 1.Hirabayashi J，Kasai，KGlycomics，coming of age!Trends Glycosci Glycotech，2000，12：I-5 2.王克夷，杜昱光.医学分子生物学杂志 2004，1(5)：261-264 J Med Mol Biol 2004，1(5)：261264 3.Huby R D，DearmanR J，Kimber IWhy are some proteins alhrgensJ? 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